導(dǎo)語：如何才能寫好一篇勇敢做自己，這就需要搜集整理更多的資料和文獻(xiàn)，歡迎閱讀由公務(wù)員之家整理的十篇范文，供你借鑒。

篇1

一般來說，一個(gè)新品牌的營(yíng)銷首先要回答三個(gè)問題：我是誰？我從哪里來？我要去哪里？對(duì)DS來說，它是雪鐵龍旗下高端豪華品牌，它來自PSA集團(tuán)、來自法國(guó)，它的目標(biāo)是在全球成為豪華汽車新的選擇。這樣的答案似乎理所應(yīng)當(dāng)，尤其是對(duì)法方來講，依托雪鐵龍這個(gè)在全球具有影響力的百年品牌似乎是DS必然的選擇。

然而，這種看似理所應(yīng)當(dāng)?shù)淖龇▍s并不一定適合中國(guó)。在歐洲，人們對(duì)DS與雪鐵龍的歷史淵源比較清楚，認(rèn)同雪鐵龍也就會(huì)認(rèn)同DS。在中國(guó)，人們不僅對(duì)DS一無所知，甚至對(duì)雪鐵龍的認(rèn)識(shí)也并不全面，很多消費(fèi)者對(duì)雪鐵龍的印象還停留在富康時(shí)代、并不那么積極。

必須承認(rèn)，這些年來，神龍汽車為塑造雪鐵龍和標(biāo)致兩個(gè)品牌做了艱苦努力、也取得了一定的效果。但對(duì)DS來說，以“源自雪鐵龍”這種身份進(jìn)入中國(guó)，雪鐵龍過去在這個(gè)市場(chǎng)上積攢的正面的、負(fù)面的東西都難以避免要附著在DS身上。當(dāng)年，在特定歷史條件下，雪鐵龍、甚至法系車在中國(guó)市場(chǎng)上都曾經(jīng)歷過一段黯淡的時(shí)期、留下過一些不很正面的印象。這些東西，DS必須與之劃清界限。

基于這種風(fēng)險(xiǎn)，有人建議，要審慎地處理DS與雪鐵龍的關(guān)系、要巧妙地把雪鐵龍身上好的東西和DS聯(lián)系在一起。雪鐵龍的底盤技術(shù)、操控感覺等等都是中國(guó)消費(fèi)者認(rèn)可的。這個(gè)建議，聽上去不錯(cuò)，可是具體實(shí)施起來卻不容易。子品牌與母品牌的關(guān)系從來就不好處理，操作好了，“子以母貴”能沾光，操作不好“一損俱損”反倒沾包了。如何拿捏其間的“度”？如何去粗取精？怎樣才不會(huì)弄巧成拙？實(shí)在太繁瑣！

所以，在我看，DS實(shí)在應(yīng)該從這種左右為難、患得患失的圈子跳出來，勇敢做自己。DS本身豐富的歷史和內(nèi)涵，完全可以支撐它建立一整套自己的價(jià)值體系和表達(dá)方式。

從戴高樂總統(tǒng)到新上任的奧朗德，都選擇DS作為座駕；50年前，DS就獲得了“法蘭西之美”的標(biāo)示，1999年英國(guó)設(shè)計(jì)界還將DS評(píng)選為“世紀(jì)經(jīng)典”。2009年，PSA集團(tuán)重啟DS品牌之后，憑借獨(dú)樹一幟的“新派豪華風(fēng)”短時(shí)間內(nèi)暢銷歐洲，被稱為“風(fēng)華絕代、女神復(fù)活”。

篇2

有人說，很多時(shí)候最真實(shí)的自己，往往是最放肆的自己，也是你最瞧不起的那個(gè)自己。而我想問，瞧不起真實(shí)的自己的人到底是誰？！真的是我們自己在瞧不起真實(shí)的自己，還是社會(huì)在透過我們的眼光瞧不起我們真實(shí)的自己？！

正如世界上沒有兩片相同樹葉，人人也生而不同，每個(gè)人都或多或少有些自己的小怪癖，這些怪癖或許我們羞于啟齒，但確實(shí)是我們最喜愛的狀態(tài)。一腔悲歡古難全，世事從來不如意。不如意之事十之八九，可與人言無二三。社會(huì)已經(jīng)扭曲、壓迫了我們?cè)S多事，如果連我們自己都要瞧不起自己，強(qiáng)硬剝奪自己所剩不多的喜愛，這世界還有什么地方可以讓自己的心靈自由呼吸呢？如果心都被禁錮，不管怎么流浪都到不了遠(yuǎn)方。

對(duì)于真實(shí)的自己，可以害羞，卻絕對(duì)不能瞧不起。真實(shí)的自己只是不像表面一般成熟穩(wěn)重，只是難過了想哭，壓抑了想大叫，常常會(huì)迷惘，愛做白日夢(mèng)，或許還不愛收拾，習(xí)慣摳腳……但我們到底也沒有妨礙到別人，也沒有違法犯事，為什么要被瞧不起呢？況且，我們多數(shù)時(shí)候都是只在自己一個(gè)人的時(shí)候展露真實(shí)的自己。獨(dú)處時(shí)，世界就是自己的，我們可以縱情享受，隨便做什么都不會(huì)受到別人的指點(diǎn)，而這時(shí)，卻聽見我們的心靈在對(duì)我們作指責(zé)？仿佛心臟被密不透風(fēng)的網(wǎng)裹緊，喉嚨被無形的大掌扼住。

社會(huì)規(guī)則的確立是為了約束我們不逾矩，能與大家和諧共處，而不是來創(chuàng)造我們的。如今我們卻竟愿意將思想放進(jìn)社會(huì)的模具中，任它打造，將自己改造成趨向完美的機(jī)器、活死人。最了解自己的人只會(huì)是自己，我們愛美、愛吃、愛哭，這并沒什么羞于啟齒的。但社會(huì)不希望我們?nèi)绱?。它宣揚(yáng)女人只許重德不許重貌，男人只許堅(jiān)強(qiáng)不許墜淚，大人永遠(yuǎn)成熟，小孩也不能頑皮。每個(gè)人按類劃分，刻出標(biāo)準(zhǔn)的模版。但我們不是這樣的，我們心里知道。

既然都知道“我就是我，是顏色不一樣的煙火”，我們首先就要自己在腦中打破固有的刻板印象。隔絕地理的墻早在我們學(xué)會(huì)奔跑、發(fā)明交通工具后就已被打破，腦中的墻過了千百年也只被敲落了幾片磚瓦而已。唯有將這墻的油漆剝落、瓦礫敲碎，徹底推倒后，我們才能勇敢接受真實(shí)的自己，進(jìn)而勇敢做真實(shí)的自己，如此才能在短暫世間收獲更大的歡樂。

篇3

從前，有一個(gè)深林里住著許多小動(dòng)物。但有一個(gè)妖怪占領(lǐng)了這個(gè)深林，從此深林里的小動(dòng)物都成了它的苦工。但好景不長(zhǎng)，那個(gè)妖怪死了，你知道為什么嗎？這件事還跌從一個(gè)月說起：

就在一個(gè)月前，有兩只小動(dòng)物一只是熊叫勇勇，另一只是鳥叫敢敢。他們聽了鳳凰姐姐的故事就決定去探險(xiǎn)把那個(gè)魔頭消滅掉，說干就干。他們來到妖怪的家，妖怪還在呼呼地睡大覺。勇勇把妖怪的武器拿走，敢敢用尖尖的嘴巴使勁扎妖怪的眼睛。妖怪什么也看不到就東倒西歪勇勇趁機(jī)用妖怪的武器砍下妖怪的頭，他們勝利而歸。聽說把妖怪弄死可以徐三個(gè)愿望勇勇說：“我要世界上最漂亮的衣服。”馬上勇勇穿上了世界上最漂亮的衣服，敢敢說：“我要讓所有的樹頭成為我的家。”立刻所有的樹都成為的他的家，還有一個(gè)愿望該怎么辦。鳳凰姐姐說：“有一只小兔子病倒了，就把這個(gè)愿望讓她的病好起來！”突然小兔子活蹦亂跳。

就是這樣，妖怪死了。

謝謝你的觀賞，請(qǐng)多多關(guān)照。

五年級(jí):蔣政

篇4

河北博野興華小學(xué)二（1）班 劉若涵

雞媽媽從屋里走出來，帶著可愛的雞寶寶找食吃。一只黑色的小公雞想：我眼睛亮，一會(huì)兒就會(huì)捉到又肥又大的蟲子。想著想著，它就獨(dú)自向一棵又高又大的柳樹那兒走去。

樹后，一只又黑又丑的野貓藏在那里。它想：這只雞真笨，自己送死，我毫不費(fèi)力就可以吃到一頓美餐啦！野貓打著如意算盤，饞得口水直流。小公雞發(fā)現(xiàn)了野貓，還沒來得及叫喚，野貓就從樹后撲過來，小公雞嚇得轉(zhuǎn)身就逃，一邊逃一邊叫：“媽媽，媽媽，快來救我呀！”

雞媽媽聽見了呼救聲，飛快地跑了過來，勇敢地沖向野貓。雞媽媽用尖尖的嘴啄野貓，用鋒利的爪子抓野貓，野貓只好逃走。小公雞得救了，它哭著說：“媽媽，我再也不離開你了?！眿寢屨f：“好孩子，以后可不要離開大家了，別哭了，咱們回家去?！?/p>

篇5

當(dāng)鋪天蓋地的黃沙襲來，許多人都趴下了，而我卻沒有，因?yàn)槲液苡赂?；?dāng)海嘯咆哮著卷來，更多的人選擇了逃跑，而我卻沒有，因?yàn)槲液苡赂?；?dāng)無盡的挫折如泉水般涌來，所有的人都崩潰了，而我卻沒有，因?yàn)槲液苡赂?#183;·····

記得第一次去勇敢地面對(duì)的事情，不是數(shù)學(xué)難題，也不是生活麻煩，而是心中的恐懼。

那次，爸爸帶著我和弟弟去蘇州樂園玩。剛進(jìn)門，一陣陣的尖叫聲傳入耳畔，我不由得哆嗦，手心冒著冷汗，后悔為什么要來。弟弟看出了我的反常，抖抖肩，嘲笑道：“哎喲，平時(shí)膽大的姐姐也會(huì)害怕這種小項(xiàng)目！”平時(shí)要面子的我，這時(shí)候怎么會(huì)讓別人看不起呢，特別是比我小的。于是我破口而出：“誰···誰，害怕這種項(xiàng)目啦！”這話剛說出來，就后悔了。弟弟奸笑：“好，既然你不怕，我們就比比！”

天下沒有后悔藥呀！這不，被弟弟拽著來到了過山車前。望著這數(shù)百米高的龐然大物，心里開始忐忑起來。邁著沉重的腳步，僅僅離我十幾米的“車”，卻感覺有幾千米。最后，還是坐上了車。過山車剛啟動(dòng)不到0.01秒，我就開始尖叫了。其他游客都莫名奇妙的看了我一眼，弟弟更是白了我一眼，我的心涼了半截。我知道，這次沒有人能救我，只有靠自己去勇敢地面對(duì)它。突然，車開始加速了，很快就要到俯沖了，我深呼吸，我不怕，你來吧！車子頓時(shí)從200米的高空傾瀉下來，頓時(shí)，尖叫聲響徹云霄，如雷霆般。閉著眼的我，緩緩地把眼睛睜開，我看到的不是恐怖的瞬間，而是大自然給予我們的美麗畫卷，如此的美！我知道，我已經(jīng)克服了恐懼，現(xiàn)在應(yīng)該是享受了！

去勇敢地面對(duì)恐懼，是我愛我自己的表現(xiàn)！

篇6

1991年，16歲的樂嘉從寧波一所中專金融專業(yè)畢業(yè)，到銀行做了會(huì)計(jì)，朝九晚五，工作穩(wěn)定?？墒撬麉s不喜歡這份工作，他的夢(mèng)想是有一份可以不用坐班、天天出差的工作。

母親為了勸阻他，甚至要和他斷絕母子關(guān)系，在和母親的“戰(zhàn)爭(zhēng)”中，樂嘉毫不退縮，堅(jiān)持要到農(nóng)村去做銷售員。父親見狀，忙托關(guān)系把他介紹到一家房地產(chǎn)公司做了銷售。遭遇了無數(shù)次挫折和碰壁后，樂嘉終于在聽完一次培訓(xùn)課程后重新振作起來，兩個(gè)月內(nèi)幫公司賣了兩套別墅。

后來在一位同事的推薦下，樂嘉成了“雅芳先生”，他的才能又一次得到了彰顯，僅兩個(gè)月他的銷售額就做到了寧波第一。1994年，他轉(zhuǎn)到雅芳上海總部工作，開始了培訓(xùn)師生涯。至此，樂嘉認(rèn)為自己的第一個(gè)夢(mèng)想實(shí)現(xiàn)了――天天出差。

因?yàn)槌霾?，他開始接觸外面的世界，也遇到了人生中的一位恩師――上海戲劇學(xué)院教授安振吉。在安教授的建議下，樂嘉又去上戲進(jìn)修。從上戲進(jìn)修完，樂嘉并沒打算當(dāng)演員，但擁有專業(yè)的表演技巧使他能把具有不同性格的人的動(dòng)作、神態(tài)、思想逼真地表現(xiàn)出來。

有了這一切的積淀，心志遠(yuǎn)大的樂嘉終于按捺不住，成立了屬于自己的演講公司。

他開始接觸西方流行的行為心理學(xué)，這種理論將人的性格對(duì)應(yīng)為4種顏色：紅色、藍(lán)色、黃色、綠色。他發(fā)現(xiàn)很多人都對(duì)這個(gè)話題感興趣，于是就將其講給自己的同事、朋友和親人聽，并將這些內(nèi)容放到演講和培訓(xùn)中，結(jié)果大受歡迎。

2010年，樂嘉成為《非誠(chéng)勿擾》的嘉賓。節(jié)目做了大半年，樂嘉對(duì)人性的敏銳的洞悉力被全國(guó)觀眾所熟知和喜愛，擁有了大量粉絲。

2013年，他在中央電視臺(tái)有了自己的節(jié)目《首席夜話》，成為《超級(jí)演說家》導(dǎo)師，出版了迄今為止他認(rèn)為自己剖析得最為深刻，也是最為人性的一本書――《本色》，該書向質(zhì)疑和否定他的觀眾們，真正詮釋了什么是生命的睿智、豁達(dá)與優(yōu)雅。

篇7

《》是1935年10月到達(dá)陜北根據(jù)地寫下的一首詩(shī)。在課堂上，老師范讀著“不怕遠(yuǎn)征難，萬水千山只等閑。......”，那一句句詩(shī)把我們引領(lǐng)進(jìn)那個(gè)血腥風(fēng)雨的年代。二萬五千里是我國(guó)革命歷程中一個(gè)驚人的壯舉。短短的《》讓我體會(huì)到一個(gè)個(gè)英雄豪杰和那英勇無畏的精神。鄭重地向全世界宣告帝國(guó)主義和對(duì)中國(guó)的迫害是完全無用的。正義永遠(yuǎn)壓倒邪惡，只有走的道路才能解放人民，贏得全中國(guó)勝利的曙光。

“五嶺逶迤騰細(xì)浪，烏蒙磅礴走泥丸。金沙水拍云崖暖，大渡橋橫鐵索寒。”我滿懷激情地讀著，想起途中戰(zhàn)士爬雪山過草地，多少戰(zhàn)士忍饑挨餓；多少戰(zhàn)士與敵人同歸于盡；多少戰(zhàn)士沒能走出草地，翻越雪山；他們永遠(yuǎn)留在了那的路上，在那兒樹立起永遠(yuǎn)的豐碑。讓我想起《金色的魚鉤》中的老班長(zhǎng)，《倔強(qiáng)的小》《豐碑》中的軍需處長(zhǎng)，他們把別人送出草地、雪山，自己卻犧牲在草海，雪海中，長(zhǎng)眠在那里。.....就是這些千百萬個(gè)英雄用鮮血和生命迎來了的勝利！

今天，我們生活在前輩拋頭顱，灑熱血換來的美好生活中，要牢記精神，繼承革命先輩光榮傳統(tǒng)，做一個(gè)合格的少先隊(duì)員，才不愧對(duì)胸前的紅領(lǐng)巾。革命的歲月雖已離我們遠(yuǎn)去，但革命精神卻永駐我們心間，它永遠(yuǎn)指引我們前進(jìn)。.....

——米子于2007-05-20

篇8

第一個(gè)月，她還算理性。一天，她和同學(xué)去逛街，路過書店，買了一本關(guān)于文學(xué)的書，那是本好書，她順手放在了床頭柜。她給自己定的目標(biāo)是每天看五頁(yè)。幾天后，她覺得太苦了，改成每天一頁(yè)。再后來，她認(rèn)為一頁(yè)起不到作用，索性也不看了。這段時(shí)間期限為一個(gè)星期。這本書看了不到五分之一，花費(fèi)了暑假近八分之一的時(shí)間。第一個(gè)月吃吃喝喝，認(rèn)為剛放暑假就應(yīng)該好好放松。結(jié)果，第一個(gè)月就這樣匆匆而過。

她也是恍然一看日歷，才發(fā)現(xiàn)已經(jīng)到了八月，她開始著急，心想二十多天后就收學(xué)了，得趕緊做作業(yè)。作業(yè)做得差不多，她卻還沒有時(shí)間完她的文學(xué)夢(mèng)。她已經(jīng)忘記了這個(gè)夢(mèng)想，她在等著，等著一個(gè)合適的時(shí)機(jī)。于是不知不覺，開學(xué)了。

兩個(gè)月的時(shí)間說短不短，說長(zhǎng)不長(zhǎng)，卻足以開始那個(gè)夢(mèng)想。她每回安慰自己的理由是，已經(jīng)買了那本書了，她認(rèn)為她還不夠格做這件事，還需要學(xué)習(xí)學(xué)習(xí)。殊不知，那本書，已經(jīng)丟棄在一個(gè)陰暗的角落里。

篇9

1860年10月6日，這是個(gè)讓所有中國(guó)人都難以忘懷的日子。這一天，兩個(gè)歐洲強(qiáng)盜，手牽著手，侵入北京，闖進(jìn)圓明園，大肆搶劫。這幫可惡的強(qiáng)盜，為了掩蓋自己的罪惡，竟將已被他們洗劫一空的圓明園放火焚燒！大火燒了三天三夜，這座舉世聞名的皇家園林就這樣毀了。熊熊燃燒的火光，映紅了北京城，也映紅了歷史的天空。直到今天，它仍然燃燒在每一個(gè)有良知的炎黃子孫的心頭。

我沒有到過北京，沒有在現(xiàn)場(chǎng)目睹過圓明園的現(xiàn)在。從課本和網(wǎng)絡(luò)的圖片上，我認(rèn)識(shí)了圓明園的殘缺不全。它僅剩的幾根殘柱，讓我想到一種古代的冷兵器，它與熊熊的火焰，形成強(qiáng)烈的反差。大家有沒有想過，當(dāng)時(shí)的清政府為什么不奮起反抗，倒讓侵略者任意在自己的地盤上燒、殺、搶、掠、奪呢？答案不言自明，那是因?yàn)橹袊?guó)當(dāng)時(shí)十分落后，別的國(guó)家都用上大炮和火槍，而我們的軍隊(duì)只有長(zhǎng)劍與大刀。我們的皇帝總是閉著眼睛叮囑：“外國(guó)人送的東西千萬碰不得，否則會(huì)喪志。只有劍和刀才是打仗時(shí)最可靠的武器……”

可是，當(dāng)英法聯(lián)軍真的闖進(jìn)來時(shí)，皇帝二話不說就跑了。他從未想到自己的話會(huì)成為一個(gè)無法彌補(bǔ)的錯(cuò)誤。開始，他們夜郎自大，傲慢無禮；隨后，他們畏敵如鼠，只知逃跑。那些被搶的、被燒的、流落海外的國(guó)寶和大水法的殘柱，一次次刺痛我的靈魂。這是我們最大的國(guó)恥。

不過，這些都已成為不會(huì)重現(xiàn)的歷史，現(xiàn)在的中國(guó)正逐漸強(qiáng)大。北京奧運(yùn)會(huì)的圓滿成功，展示了一個(gè)大國(guó)風(fēng)采。神舟七號(hào)升天，使中國(guó)成為第三個(gè)登上太空的國(guó)家。這些都是中國(guó)人民努力的成果，是中國(guó)開始強(qiáng)大的證明。只有民富國(guó)強(qiáng)，外國(guó)人才不敢侵略我們。

篇10

【關(guān)鍵詞】 牛蒡子苷； 抗腫瘤活性； 細(xì)胞凋亡； CAPAN-1細(xì)胞株

Abstract：ObjectiveTo evaluate the anti-tumor effect and mechanism of arctiin on the human pancreas cancer cell (CAPAN-1) in vitro and vivo. MethodsCAPAN-1 cell was cultured in medium containing serial concentration of arctiin for 72 hours. Then the growth rate and the morphological change were analyzed. Cell apoptosis percentage was measured by TUNEL method and FCM. Cell cycle phase distribution was measured by FCM. The expression of proliferation and apoptosis associated proteins of bax，bcl-2 in CAPAN-1 cell were determined using immunocytochemistry. CAPAN-1 cell tumor-bearing nude mice were intraperitoneally administered arctiin and 5-FU and the tumor growth rate was observed.ResultsArctiin could inhibit proliferation of CAPAN-1 cell. The cell cycle was arrested in G0/G1 phase and apoptosis was induced（P＜0.05）. The onset of apoptosis was related to the up-regulation of bax protein（P＜0.01）and down-regulation of bcl-2 in protein level（P＜0.05）. Arctiin could inhibit the tumor growth， and inhibition rate was 41.7%.ConclusionThese studies suggest that arctiin can inhibit CAPAN-1 cells growth and one of mechnnisnms is to induce cell apoptosis.

Key words：Arctiin； Anti-tumor effect； Apoptosis； CAPAN-1 cell line

牛蒡子是具有疏散風(fēng)熱、宣肺透疹、解毒利咽的中藥，且常用于抗癌方劑中。牛蒡子主要含牛蒡子苷（arctiin）、牛蒡子苷元（arctigenin）、牛蒡子酚A、B（lappaol A，B）、脂肪油等［1］。近來研究表明，牛蒡子苷及牛蒡子苷元在動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中具有抗癌活性 ［2～4］。牛蒡子苷對(duì)CAPAN-1細(xì)胞是否具有抑制作用尚無報(bào)道，為進(jìn)一步研究牛蒡子苷的抗腫瘤活性，利用CAPAN-1細(xì)胞進(jìn)行體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，探討牛蒡子苷是否具有抗胰腺癌活性及其作用機(jī)理。

1

材料

牛蒡子苷購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所；CAPAN-1細(xì)胞株由上海細(xì)胞研究所提供；FCS-1640細(xì)胞培養(yǎng)液，胎牛血清，抗生素，胰蛋白酶等（GIB Co）；SP免疫組化試劑盒，小鼠抗人bcl-2及bax單克隆抗體（Santa Cruz Co）。

2

方法

2.1 牛蒡子苷對(duì)CAPAN-1細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 取FCS-1640細(xì)胞培養(yǎng)液中對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CAPAN-1細(xì)胞3ml(細(xì)胞濃度約為6.5×103個(gè)·ml-1)，接種于直徑35mm的培養(yǎng)皿中。隨機(jī)分為用藥組和對(duì)照組。用藥組分別加入用0.02%二甲亞砜溶解的牛蒡子苷0.5，1，1.5mg·ml-1；對(duì)照組加入0.02%二甲亞砜。每一濃度3個(gè)重復(fù)培養(yǎng)皿，培養(yǎng)72h，每24h用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測(cè)癌細(xì)胞數(shù)，設(shè)對(duì)照組癌細(xì)胞增殖率為100%，用下面公式計(jì)算各用藥組癌細(xì)胞增殖率。

增殖率（%）=［（用藥組各時(shí)段癌細(xì)胞數(shù)－用藥組開始癌細(xì)胞數(shù)）/（對(duì)照組各時(shí)段癌細(xì)胞數(shù)－對(duì)照組開始癌細(xì)胞數(shù)）］×100%。

2.2 癌細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 倒置顯微鏡下動(dòng)態(tài)觀察培養(yǎng)皿中CAPAN-1細(xì)胞用藥前后的變化。

2.3 FCM細(xì)胞周期檢測(cè)

收集對(duì)照組和加牛蒡子苷1 μg·ml-1的用藥組培養(yǎng)24，48，72h的CAPAN-1細(xì)胞；PBS洗滌后，4℃下用75%酒精固定12 h以上；離心除去酒精，PBS洗滌，加入10mg·ml-1 RNA酶溶液150 μl，37℃水浴30 min，加入碘化丙啶（PI），300目尼龍網(wǎng)過濾后4℃下放置15 min，用FCM測(cè)定細(xì)胞周期各時(shí)相細(xì)胞的百分比及細(xì)胞凋亡率。

2.4 DNA末端原位標(biāo)記染色法（TUNEL）檢測(cè)細(xì)胞凋亡 在培養(yǎng)皿中放置蓋玻片，CAPAN-1細(xì)胞在蓋玻片粘壁生長(zhǎng)后，用藥組加入1 μg·ml-1牛蒡子苷，收集對(duì)照組和用藥組培養(yǎng)24，48，72h附細(xì)CAPAN-1胞的蓋玻片，按TUNEL試劑盒標(biāo)記染色，結(jié)果判斷：以細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕褐色為陽(yáng)性。光鏡下計(jì)算凋亡指數(shù)（Apoptotic index，AI）。AI是指每張TUNEL玻片選取5個(gè)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)最多的高倍鏡視野，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與總細(xì)胞數(shù)的百分比。

2.5 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)增殖凋亡調(diào)控相關(guān)基因bax及bcl-2的蛋白表達(dá) 分別收集對(duì)照組和加牛蒡子苷1 μg·ml-1的用藥組培養(yǎng)48 h的CAPAN-1細(xì)胞，用S-P法進(jìn)行染色。小鼠bax單克隆抗體按1∶200稀釋，bcl-2單克隆抗體按1∶50稀釋，陰性對(duì)照以PBS代替抗體。結(jié)果判斷：細(xì)胞染色呈棕黃色為陽(yáng)性，隨機(jī)計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，測(cè)定每一指標(biāo)的標(biāo)記指數(shù)（labeling index，LI），重復(fù)3次，取均值。LI=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)×100%。

2.6 荷瘤Balb/c裸小鼠腫瘤抑制實(shí)驗(yàn) 體重21 g左右的雌性Balb/c裸小鼠20只，于裸小鼠右側(cè)腋窩皮下接種CAPAN-1細(xì)胞2×106 個(gè)（0.1 ml），接種后第8天隨機(jī)分成對(duì)照組和用藥組，每組10只。牛蒡子苷組用牛蒡子苷10 mg·kg-1（用0.02%二甲亞砜溶解），陽(yáng)性對(duì)照組用5-FU 30 mg·kg-1·d-1，對(duì)照組用0.02%二甲亞砜溶液，腹腔注射1次/d，連續(xù)10 d。移植腫瘤細(xì)胞第30天拉頸處死小鼠，切除腫瘤稱重并按下面公式計(jì)算抑瘤率：

抑瘤率(%) = (1－用藥組平均瘤重/ 對(duì)照組平均瘤重)×100%。

2.7

資料統(tǒng)計(jì)分析 所有數(shù)據(jù)資料用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件分析處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用±s表示，各組間比較用t檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 牛蒡子苷對(duì)CAPAN-1細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 用藥組與對(duì)照組相比CAPAN-1細(xì)胞數(shù)和增殖率減少，均呈濃度和時(shí)間依賴性（見圖1及表1）。表1 牛蒡子苷對(duì)CAPAN-1細(xì)胞增殖率的影響

3.2 癌細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 在倒置顯微鏡下觀察CAPAN-1細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，見用藥組癌細(xì)胞數(shù)明顯減少，細(xì)胞變小，折光性差，有的細(xì)胞破碎，隨后脫落飄浮在培養(yǎng)液中。而對(duì)照組的癌細(xì)胞形態(tài)上無明顯改變，生長(zhǎng)良好。

3.3 牛蒡子苷對(duì)CAPAN-1細(xì)胞周期和凋亡率的影響 FCM檢測(cè)結(jié)果：用藥組與對(duì)照組比較細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，并出現(xiàn)細(xì)胞凋亡（見表2）。TUNEL法檢測(cè)結(jié)果：用藥組與對(duì)照組比較細(xì)胞凋亡率增高，差異具有顯著性意義，且隨處理時(shí)間增加細(xì)胞凋亡率亦增加（見表3）。 表2 牛蒡子苷對(duì)CAPAN-1細(xì)胞周期及凋亡的影響 表3 TUNEL法檢測(cè)CAPAN-1細(xì)胞的凋亡率

3.4 牛蒡子苷對(duì)bax及bcl-2蛋白表達(dá)的影響 處理48 h后，與對(duì)照組相比bax標(biāo)記指數(shù)LI增加（t=38.09 P＜0.01＝，bcl-2標(biāo)記指數(shù)LI降低（t=5.19 P＜0.05），見表4。表4 牛蒡子苷對(duì)CAPAN-1細(xì)胞bax、bcl-2蛋白表達(dá)的影響 與對(duì)照組相比較，* P＜0.01 **，P＜0.05

3.5 牛蒡子苷對(duì)荷瘤Balb/c裸小鼠腫瘤抑制實(shí)驗(yàn) 牛蒡子苷組和陽(yáng)性對(duì)照組裸小鼠平均瘤重小于對(duì)照組平均瘤重，差異具有顯著性意義（t=5.89， t=12.42，P

4 討論

最近實(shí)驗(yàn)研究表明，牛蒡子苷在動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中具有抗肺癌，白血病活性。與5-FU、環(huán)磷酰胺及順鉑合用，可減少或阻止抗癌劑抗藥性的增加，并能夠抑制體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞對(duì)葡萄糖的利用［5～8］。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)胰腺癌細(xì)胞株（CAPAN-1）的體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)，以進(jìn)一步證明牛蒡子苷是否具有抗胰腺癌活性。

在利用牛蒡子苷對(duì)CAPAN-1細(xì)胞進(jìn)行的體外實(shí)驗(yàn)中。牛蒡子苷能抑制CAPAN-1細(xì)胞的增殖；通過觀察CAPAN-1細(xì)胞的形態(tài)，觀察到癌細(xì)胞生長(zhǎng)被抑制；TUNEL標(biāo)志法觀察到CAPAN-1細(xì)胞凋亡；FCM檢測(cè)CAPAN-1細(xì)胞周期和凋亡率結(jié)果顯示，牛蒡子苷先將細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期，然后誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。bax和bcl-2是一對(duì)凋亡相關(guān)調(diào)控基因，bax主要通過與其家族bcl-2形成二聚體而發(fā)生作用。當(dāng)bcl-2表達(dá)較高時(shí)，bcl-2和bax形成異源二聚體而抑制凋亡；當(dāng)bax表達(dá)較高時(shí)，bax之間形成同源二聚體而促進(jìn)凋亡［9］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，牛蒡子苷作用于CAPAN-1細(xì)胞后bcl-2基因表達(dá)減弱，bax基因表達(dá)增強(qiáng)，說明其可下調(diào)bcl-2及上調(diào)bax表達(dá)，這可能為牛蒡子苷誘導(dǎo)CAPAN-1細(xì)胞凋亡的機(jī)理之一。從癌細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)中可得出牛蒡子苷能抑制體外培養(yǎng)的CAPAN-1細(xì)胞的生長(zhǎng)，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

在體外實(shí)驗(yàn)中，對(duì)癌細(xì)胞有抑制或殺傷作用的藥物，在活體中由于各種綜合因素的作用不一定仍具有抑制腫瘤的作用。為此進(jìn)行了CAPAN-1細(xì)胞荷瘤裸小鼠腫瘤抑制實(shí)驗(yàn)。結(jié)果牛蒡子苷能夠抑制荷瘤裸小鼠腫瘤的生長(zhǎng)。但抑瘤率較5-FU弱，表明牛蒡子苷在活體上也具有抑制CAPAN-1細(xì)胞的活性。通過對(duì)CAPAN-1細(xì)胞的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，證明牛蒡子苷具有抗胰腺癌活性，其作用機(jī)理之一是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

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