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關(guān)鍵詞基因治療;治療方式;發(fā)展前景

中圖分類號r459.9文獻標識碼a文章編號 1007-5739(2010)01-0025-01

美國是世界上最早開展基因治療的國家,也是目前開展基因治療最多的國家。我國在1991年7月開始基因治療的臨床研究,最早的工作是對b型血友病的基因治療及利用抑癌基因?qū)Π┌Y的基因治療[1]。基因治療目前主要用于治療對人類健康威脅嚴重的疾病,包括遺傳病、惡性腫瘤、心血管疾病、感染性疾病等[2]。

1基因治療的方式

1.1體內(nèi)基因治療

體內(nèi)基因治療是指將具有治療功能的基因直接轉(zhuǎn)入病人的某一特定組織中。利用反轉(zhuǎn)錄病毒載體已成功地將真核基因轉(zhuǎn)入動物細胞,但通過質(zhì)粒dna的直接操作,將更加省時而且產(chǎn)量較高;采用溫和病毒載體的體內(nèi)基因治療主要是通過腺病毒和單純皰疹病毒來完成的,即將載有矯正基因的載體直接注射入需要這些基因的組織。以腺病毒為載體的體內(nèi)療法在遺傳性疾病方面,目前主要見于囊性纖維變性的基因治療研究。多數(shù)研究表明,基因治療糾正了呼吸道上皮的氯離子轉(zhuǎn)運缺陷,使跨上皮基礎(chǔ)電位下降,肺功能有所改善[3]。

1.2反義療法

反義療法主要是通過阻遏或降低目的基因的表達而達到治療的目的。反義療法是通過引入目的基因的rna的反義序列而達到上述目的。當引入的反義rna與mrna相配比后,用于翻譯的mrna的量就大大減少,因而合成的蛋白的量也相應(yīng)大大減少。引入的反義序列也可能與基因組dna互補配對,從而阻遏mrna的轉(zhuǎn)錄。這2種情況都會使細胞中靶基因編碼的蛋白合成大大減少,以達到基因治療的目的。

1.3通過核酶的基因治療

20世紀80年代初,美國科學家cech和altman發(fā)現(xiàn)了核酶,核酶是指由rna組成的酶,能夠序列特異性地抑制靶mrna。近年來,核酶在抑制癌基因的表達[4]、增強腫瘤對藥物的敏感性及抑制腫瘤血管的生成等方面的應(yīng)用得到了廣泛的研究。

1.4自殺基因療法

自殺基因療法是惡性腫瘤基因治療領(lǐng)域最有希望的方法之一,已廣泛用于各種惡性腫瘤的基礎(chǔ)研究和臨床試驗性治療。它是用藥物敏感基因轉(zhuǎn)染腫瘤細胞,其基因表達的產(chǎn)物可以將無毒性的藥物前體轉(zhuǎn)化為有毒性的藥物,影響細胞的dna合成,從而引起該腫瘤細胞的死亡。

2基因治療存在的問題

2.1基因治療的社會和倫理問題

基因治療不僅僅是一種醫(yī)療方法,它還涉及很多其他問題。因為當人們試圖“糾正”人類自身“不正?！钡幕驎r,這種糾正的后果是無法預(yù)料的。由于人類的遺傳信息非常復(fù)雜,轉(zhuǎn)基因也可能帶來不可預(yù)料的后果,沒有人能保證這種基因結(jié)構(gòu)的改變絕對不會造成人類某一未知功能的缺失。另外,當人們試圖把基因治療引入生殖細胞時,又涉及后代基因結(jié)構(gòu)的改變問題,且改變將直接影響這個“未來人”,這是一個很難解決的倫理問題。

2.2基因治療的技術(shù)問題

目前,基因治療的對象是單基因的缺陷,但許多疾病涉及多個基因之間復(fù)雜的調(diào)控和表達關(guān)系。對這類疾病的基因治療難度很大,因為向細胞中導(dǎo)入多個基因后,使幾個基因之間能保持正常的調(diào)控關(guān)系幾乎是不可能的。即使是單基因缺陷癥,使導(dǎo)入細胞的基因能正常表達也是一個較復(fù)雜的問題。將基因?qū)爰毎?其表達量的多少是直接影響能否達到治療的目的和有無副作用的關(guān)鍵。但這個問題將會在人類基因組計劃完成的基礎(chǔ)上,對人類后基因組計劃的開展,弄清了人類基因之間復(fù)雜的調(diào)控聯(lián)系后而最終得到解決。只有這樣,才能在基因治療中盡量做到使導(dǎo)入的基因處于正確的調(diào)控下,取得治療效果,消除副作用。

3展望

以基因轉(zhuǎn)移為基礎(chǔ)的基因治療要在臨床上很好地應(yīng)用,還有待理論和各種技術(shù)的進一步發(fā)展。過去20~30年基因治療的發(fā)展已取得了巨大成就,已被看成是對先天和后天基因疾病的潛在有效的治療方法,不過其依然存在缺少高效的傳遞系統(tǒng)、缺少持續(xù)穩(wěn)定的表達和宿主產(chǎn)生免疫反應(yīng)等問題。今后基因治療研究將向2個方向發(fā)展:一是基礎(chǔ)研究更加深入,以解決在臨床應(yīng)用中遇到的一些困難及基因治療本身需要解決的一些難點;二是臨床試用項目增多,實施方案更加優(yōu)化,判斷標準更加客觀,評價效果更加精確?？傊?隨著分子生物學、分子遺傳學以及臨床醫(yī)學的發(fā)展,基因治療也會不斷發(fā)展,日趨成熟,很多難題會得到解決,并在臨床上得到廣泛應(yīng)用。 編輯整理

4參考文獻

[1] 李立家,肖庚富.基因工程[m].北京:科學出版社,2004.

[2] anderson w.human genetherapy[j].nature,1998(392):25.

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但是其在醫(yī)學上的價值人類依舊不能過于樂觀。

一直備受人關(guān)注的人類基因圖譜最近再次迎來了“喜訊”：由中、美、英等國共同發(fā)起的大型國際合作項目“千人基因組計劃”最新研究成果10月31日在《自然》在線發(fā)表。該協(xié)作組公布了1092個高分辨率人類基因組遺傳變異整合圖譜。

基因治療采取極為謹慎態(tài)度

“千人基因組計劃”從實施到現(xiàn)在，已經(jīng)整整5年時間。

不過在中國科學院基因研究所醫(yī)學博士甄二真看來，盡管在科學研究上，這樣的測序有著比較大的價值和意義，但是實際應(yīng)用到人類的健康和疾病治療，依舊還有很長的路要走。

“就算能夠?qū)?dǎo)致一些疾病發(fā)生的基因片段或者特定位置找出來，現(xiàn)在人類對它們實際上還是無能為力?！闭缍嬲f。

隨著基因科學和技術(shù)的發(fā)展，目前國內(nèi)外的很多實驗室已經(jīng)可以通過敲除、關(guān)閉、替換具體基因片段或者特定位置的方式對老鼠等一些實驗動物進行部分遺傳性疾病的治療實驗，但是，這樣的實驗?zāi)壳耙琅f停留在實驗室階段。

“基因領(lǐng)域中有很多東西對人類而言還十分陌生，盡管人類現(xiàn)在已經(jīng)了解到人體的一些基因片段或者特定位置的變異是某類疾病的緣由，但是將其敲除、關(guān)閉或者替換，會出現(xiàn)什么樣的結(jié)果，存在很大的不確定性。因此人類當前實施這樣的手術(shù)在安全性上得不到充分的保證?！闭缍嬲f。

國家人類基因組南方研究中心研究員韓澤廣近些年來一直在基因方向上進行肝癌的研究，但現(xiàn)在還沒有可靠的方法改造突變基因來治療癌癥。

韓澤廣說，因為倫理上的一些風險和爭議，目前世界各國對于人類基因工程治病一直采取的都是一種極為審慎的態(tài)度。

基因治療存在炒作質(zhì)疑

人類基因組計劃從1990年正式啟動、先后共有美國、英國、法國、德國、日本和中國共6個國家的眾多科學家共同參與，其預(yù)算高達30億美元。但是，最近國內(nèi)外不少生物學家及醫(yī)學專家也都開始質(zhì)疑基因治療技術(shù)的炒作。

2000年，美國總統(tǒng)克林頓與美兩大人體基因研究組織的科學家在白宮聯(lián)合宣布：有史以來的第一個人類基因組草圖完成。

“利用這個新知，人類將獲得巨大利益。它能徹底改變我們對大多數(shù)疾病的診斷、預(yù)防和治療的方式。”克林頓當時如是說。另外他還預(yù)言，未來幾年人類通過基因手段有望治愈阿爾茨海默癥、帕金森氏癥、糖尿病和癌癥等。但是時至今日，這些疾病依舊還在嚴重威脅著人類的健康，人類基因圖譜的公布對這些疾病的治療并沒有發(fā)揮實質(zhì)性的作用。

廣州中醫(yī)藥大學教授曾慶平認為，盡管現(xiàn)在高分辨率的人類基因組遺傳變異整合圖譜已經(jīng)公布，但是其在醫(yī)學上的價值人類依舊不能過于樂觀。

曾慶平說，如果將人類基因組計劃與千人基因組計劃作一個比較，那么可以說人類基因組計劃的完成是印刷了一部生命的“天書”，而千人基因組計劃的完成就是把這部“天書”重印或再版一次，只不過其間作過重大修改。形象地說，這些基因圖譜上的“基因序列恰如一本火星文小說，沒有幾個地球人能讀懂”，另外現(xiàn)在將基因變異通譯成疾病風險的“字典”也還沒有完全編撰出來。

警惕“基因療法”騙局

甄二真說，這些年來，更為嚴重的是，一些人開始借著全球人類基因組計劃和千人基因組計劃研究成果對患者進行忽悠和欺騙。

目前在國內(nèi)，有不少醫(yī)院都在利用“基因療法”或“基因工程”治病。有的醫(yī)院稱自己能進行“基因療法”，能以最新的科技治療乙肝病人；有廣告稱，某醫(yī)療機構(gòu)從研究人體基因入手，根據(jù)破譯的人體糖尿病基因密碼，獨創(chuàng)了糖尿病“基因療法”，成功研制出某種新藥。甚至一些皮膚病醫(yī)院也都開始打著“基因療法”的招牌。

甄二真告訴記者，目前國內(nèi)所有的醫(yī)療機構(gòu)聲稱的“基因療法”及“基因工程”根本就不靠譜，他們有很多人甚至自己也不知道“基因工程”是怎么回事，所謂的“基因療法”也更不可靠。

“其實，現(xiàn)在進行宣傳的大多是小型醫(yī)院和民營醫(yī)院。真正有實力的三甲醫(yī)院幾乎看不到這樣的宣傳?！闭缍嬲f目前在世界上，還沒有一個國家有過基因工程成功治病的案例，美國1999年曾經(jīng)臨床嘗試利用基因操作的方式對一個囊腫性纖維化遺傳病患者進行治療，但是在治療過程中，患者卻意外發(fā)生了死亡。

“現(xiàn)在國內(nèi)一些聲稱進行基因治療的，他們的說法都比較模糊，只是患者不了解而已?！?甄二真說。

近些年，利用人類基因圖譜，國內(nèi)外有公司已經(jīng)開始開發(fā)貯存?zhèn)€人基因組序列數(shù)據(jù)的“健康風險身份證”，在未來，也許我們只要花上不到萬元甚至是更少的費用就可以擁有一張自己的“健康風險身份證”，通過該證，我們就可以了解到我們將來患某種疾病的風險，并提前實施積極的預(yù)防。

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1990年美國首次成功地進行腺苷脫胺酸（ adenosine deam inase， aDA）缺乏的基因治療（ gene therapy）以來，基因治療已成為當前生物醫(yī)學中進展最快的領(lǐng)域之一［1］?；蛑委熢诩顾钃p傷（ spinal cordIn-jury， sCI）后軸突再生中亦可望成為有效的手段之一［2—5］。利用外源基因在靶細胞（包括神經(jīng)元）中的表達，以改變神經(jīng)元某些內(nèi)在特性，從而進一步探索 sCI后神經(jīng)元的存活能力，再生特性和功能恢復(fù)的分子機理，最終為 sCI的治療探討新途徑是目前治療 sCI的研究方向。它有助于把 sCI治療提到一個新的水平。值得我們進一步研究。

一、 sCI基因治療有關(guān)分子生物學基礎(chǔ)

基因轉(zhuǎn)移（ gene transrer）是實現(xiàn)基因治療的關(guān)鍵技術(shù)［6］。因此，基因治療的首要步驟是轉(zhuǎn)導(dǎo)基因的分子構(gòu)建。一般轉(zhuǎn)導(dǎo)基因由目的基因 cDNA，啟動子／增強子和載體三部分組成。目的基因重組時除本身特有的（ cD-NA）序列外，通常還需進行必要的修飾，如轉(zhuǎn)錄起始修飾，翻譯起始，內(nèi)含子和聚腺苷酸化信號等的修飾。用于重組的啟動子／增強子，一般有三種：強組成型（ strongconstita-tive），管家型（ housekeeping），及組織持異型啟動子（ tissuesepcific），其中最常用為第一型［7］。理想的體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移載體要求：轉(zhuǎn)移具有細胞靶向性，導(dǎo)入基因的表達可調(diào)控，而且轉(zhuǎn)移的方法簡便易行。用于 sCI的基因轉(zhuǎn)移載體主要是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體（ retroviralvector），即乳腺病毒、莫羅尼小鼠白血病病毒和勞斯肉瘤病毒等。構(gòu)建轉(zhuǎn)錄病毒載體的基本原理是：病毒的長末端重復(fù)序列（ longterrminalrepeat， lTR）可以對插入的外源基因進行有效轉(zhuǎn)錄，這樣先在體外構(gòu)建反轉(zhuǎn)錄病毒前病毒 dNA載體，即酶切去除基因組中的反式作用區(qū)域（ gag， polenv基因區(qū)域），產(chǎn)生缺陷型的反轉(zhuǎn)錄病毒，這種病毒只具有控制感染和整合的序列（即順式作用區(qū)域）。缺陷型病毒載體必須依賴包裝細胞提供的蛋白質(zhì)才能完成包裝，產(chǎn)生帶有外源基因的偽病毒。它能感染受體細胞，載體 dNA將依靠其 lTR整合入受體細胞染色體基因組，這樣外源基因被帶入宿主細胞并得以表達［2、3、6、7］。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染率高，最常用于體外間接基因治療，其缺點是要求靶細胞必須有增殖和分裂特性［8］。此外， cao（1995）［9］等研究用陽離子脂質(zhì)體直接注入 cNS作基因轉(zhuǎn)移獲得成功。但因陽離子脂質(zhì)體對 cNS有毒性，故目前致力于發(fā)展非病毒技術(shù)，一種陽離子多聚體一聚乙烯亞胺（ polyetnyl－ enimine）業(yè)已用于基因轉(zhuǎn)移［10］。另有 selle［6］（1993）等報道的復(fù)制缺陷腺病毒也是一種適用于神經(jīng)系統(tǒng)的理想載體。

在 sCI治療中，由于受體細胞要植入脊髓內(nèi)，因此所用受體細胞應(yīng)當符合一定的標準［4、6］：①容易獲取和繁殖；②移植后能長期存活且能繼續(xù)分裂和具有活力。③無免疫源性及形成腫瘤的危險。目前已用于 sCI試驗有雪旺氏細胞（ schwann cell， sC）和成纖維細胞［2、3、11］。此外，肌母細胞也是具有應(yīng)用前景的較好受體細胞，研究表明肌母細胞轉(zhuǎn)移至 cNS至少可活6個月，且無腫瘤源性［12］。

基因治療的實施，有賴于將目的基因準確、高效地轉(zhuǎn)入靶細胞，并使之安全，高效和可控地表達。基因治療中基因轉(zhuǎn)移的策略主要有兩種，即活體外法（ exvivo approach）和在體法（ invivo approach）?；铙w外法就是在體外先對適當細胞進行遺傳修飾，使其表達和分泌特定的重組蛋白，然后將修飾細胞移植入活體神經(jīng)組織，通過神經(jīng)遞質(zhì)替代或神經(jīng)營養(yǎng)因子（ neurotrophic factor， nTF）和／其它治療因子的引入恢復(fù)正常的神經(jīng)功能。這種方法尤其適于因缺乏 nTF或神經(jīng)遞質(zhì)前體分子等可擴散物質(zhì)所致的 cNS疾病。如帕金森氏?。?parkinson＇ s diesease， pD）及 cNS損傷。

在體法是利用適當?shù)闹亟M病毒或化學基因轉(zhuǎn)移載體將目的基因及有治療作用的重組蛋白直接轉(zhuǎn)移，效率較低，故較少采用。此外，活體外法可采用自體的工程細胞移植，在體外可對高表達細胞克隆進行篩選，有效的控制移植細胞的數(shù)量和質(zhì)量，應(yīng)用立體定位和成像技術(shù)可以將工程細胞十分準確地移植到 cNS特定的區(qū)域內(nèi)，以保證在局部產(chǎn)生高濃度的治療因子。

二、基因治療 sCI的現(xiàn)狀和展望

基因治療 sCI尚處于實驗探索階段。目前，主要是采用 nTF基因修飾雪旺氏細胞（ sC）或成纖維細胞后再將其植入鼠的脊髓損傷區(qū)，觀察其軸突再生的情況［2、3、11］。 tuszyski（1994）［11］將 nGF基因?qū)肱囵B(yǎng)的 sC內(nèi)，再將 sC移植到損傷的脊髓，發(fā)現(xiàn) sC在體內(nèi)能穩(wěn)定地表達 nGF并促進軸突的再生。同年 tuszynski等［2］利用來源于莫洛氏鼠白血病的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，將人的 nGF基因?qū)胧蟪衫w維細胞中，再將成纖維細胞移植到半橫貫損傷的鼠脊髓中（ t7平面）。1年后成纖維細胞仍能表達 nGF，電鏡及免疫組化（ cGRP）檢查，發(fā)現(xiàn)有大量的脊髓軸突再生（感覺纖維）。1996年， tuszynski等［3］采用同樣方法，又將 nGF基因?qū)氤衫w維細胞中，并將其移植到半橫斷損傷的鼠脊髓中（ t7平面），14月后，通過 rT— pCR技術(shù)鑒定成纖維細胞仍表達 nGF。電鏡、免疫組化（ gFAP、 cHAT、 tH、5— hT， cGRP）檢查發(fā)現(xiàn)有大量的（感覺和運動）軸突再生。作者在國際上首次構(gòu)造 po—5＇— flanking介導(dǎo)的21.5KD髓鞘堿性蛋白微基因（暫命名為 pSVPoMcat）的基礎(chǔ)上，通過陽離子脂質(zhì)體導(dǎo)入 sC中，然后再將基因修飾的 sC移植入成鼠半橫斷損傷脊髓，觀察其對 sCI的再生修復(fù)作用，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn) pSVPoMcat微基因修飾 sC對 sCI后細胞凋亡有抑制作用［13］。

篇4

原發(fā)性肝癌(Primary hepatic carcinoma，PHC)是常見的惡性腫瘤之一。目前對PHC主要治療方法有手術(shù)治療、放療、化療以及綜合治療等，然而治療效果并不理想。隨著分子生物學和免疫學技術(shù)的發(fā)展，基因治療技術(shù)在腫瘤的治療中具有廣闊的前景?；蛑委煹姆绞接袃深?，一類為基因矯正和置換；另一類為基因增補，不去除異常基因，而是通過外源基因的非定點整合，從而補償缺陷基因的功能，達到治療目的。本文就原發(fā)性肝癌的基因治療進展綜述如下。

1反義基因治療

肝癌的發(fā)生、發(fā)展過程中許多癌基因及生長因子的基因產(chǎn)物大量表達，應(yīng)用反義核酸在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平阻斷某些基因的異常表達，以期阻斷癌細胞內(nèi)的異常信號傳導(dǎo)，使癌細胞進入正常分化軌道或引起細胞凋亡，從而抑制腫瘤的生長。反義基因包括反義RNA、反義DNA和核酶3類。根據(jù)堿基互補的原理，利用與目標基因特定序列互補的短鏈核苷酸片段來封閉目標基因表達，或利用核酶與相應(yīng)的mRNA結(jié)合使其降解，均可達到基因治療的目的。Wang等［1］利用AFP反義寡核苷酸治療體外和裸鼠的SMMC7721肝癌模型取得了明顯的抗癌作用，減少了AFP的表達，抑制SMMC7721細胞的增生。有研究顯示［2］，引用反義胰島素養(yǎng)生長因子(Insulingrowth factor I，IGFI) 寡核苷酸轉(zhuǎn)染人肝癌細胞，發(fā)現(xiàn)肝癌細胞的凋亡陽性指數(shù)明顯增加，并且被轉(zhuǎn)染的癌細胞的CEA和AFP的分泌下降，表明反義IGFI寡核苷酸可以抑制肝癌細胞的增殖、促進分化并誘導(dǎo)腫瘤細胞的凋亡。

2自殺基因治療

某些病毒、細菌等原核生物含有一類基因，其編碼的酶能將原來無毒的藥物前體轉(zhuǎn)化為具有細胞毒性的代謝物而殺傷宿主細胞，這類基因稱為“自殺基因”。這種特有的轉(zhuǎn)換酶基因-自殺基因?qū)塍w內(nèi)后，利用其產(chǎn)生的酶將無毒或低毒的藥物前體轉(zhuǎn)成細胞毒性代謝產(chǎn)物，從而殺死腫瘤細胞。近年來有關(guān)此類研究顯示出良好的應(yīng)用前景。目前常用針對肝癌基因治療的有單純病毒Ⅰ型胸苷嘧啶激酶/戊環(huán)鳥苷系(HSVTK/GCV) 和胞嘧啶脫氨酶/5氟胞嘧啶(CD/5Fc)等系統(tǒng)。有研究表明［3］，將“自殺基因”單純皰疹病毒胸腺嘧啶激酶(Herpes Simplex Virus Thymidine Kinease，HSVTK)轉(zhuǎn)染腫瘤組織，則該細胞的HSVTK將前體藥Gancyclovir(GCV)轉(zhuǎn)化為對分裂細胞有殺傷作用的代謝產(chǎn)物，特異性殺傷腫瘤細胞，對肝細胞肝癌在體外有一定的療效。Won等［4］通過單純皰疹病毒將AFP反轉(zhuǎn)剪接靶RNA構(gòu)成酶導(dǎo)入肝癌細胞，取代HCC高效表達AFP的RNA殘基，結(jié)果明顯延緩腫瘤細胞生長并降低了細胞中表達AFP的RNA水平。

3免疫基因治療

免疫基因治療通過基因重組技術(shù)增強機體的抗腫瘤免疫功能而達到治療腫瘤的目的。目前有基因疫苗免疫治療、免疫刺激性因子免疫治療、共刺激分子免疫治療、活化的淋巴細胞進行過繼免疫治療、DC為基礎(chǔ)的免疫治療?；蛞呙缰傅氖荄NA疫苗，即將編碼外源性抗原的基因插入到含真核表達系統(tǒng)的質(zhì)粒上，然后將質(zhì)粒直接導(dǎo)入人或動物體內(nèi)，讓其在宿主細胞中表達抗原蛋白，誘導(dǎo)機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答。DC是體內(nèi)最強專職抗原遞呈細胞，能有效刺激靜息的細胞，誘發(fā)初次免疫應(yīng)答，還具有發(fā)動和調(diào)節(jié)抗腫瘤免疫反應(yīng)的特性。薛剛等［5］應(yīng)用IFNγ修飾的DC刺激T淋巴細胞，發(fā)現(xiàn)IFNγDC可促進T細胞增殖，并誘導(dǎo)T細胞向Th1分化。IFNγ的修飾可明顯增強肝癌細胞抗原負載的DC所活化的T細胞對肝癌細胞的殺傷作用。由于IFNγ的修飾能促進DC成熟，增強DC促進T淋巴細胞增殖的作用，誘導(dǎo)細胞免疫，增強T細胞的細胞毒作用，使T細胞能有效地殺傷腫瘤細胞，將VEGFR和Tie 基因共同轉(zhuǎn)染DC，不僅活化了特異性CTL，還可以阻止腫瘤新生血管生成，從而將腫瘤免疫治療和抗腫瘤新生血管生成治療有效結(jié)合起來［6］。

4抑癌基因治療

到目前為止發(fā)現(xiàn)的抑癌基因有p53，轉(zhuǎn)甲狀腺基因及其他抗癌基因和Nras，Cmyc，Cest2，IGFⅡR以及CSF1等，在所有的抑癌基因中p53基因的突變率較高，它的失活會阻止細胞進入凋亡，從而使之處于持續(xù)分裂狀態(tài)而增加突變及轉(zhuǎn)化的概率。通過恢復(fù)或添加腫瘤細胞中失活或缺乏的抑癌基因，恢復(fù)抑癌基因的功能，從而抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，常用野生型p53、p16 等。p53基因的突變或者失活不僅使細胞本身周期失調(diào)具有致瘤性，并且可以影響細胞對其他凋亡信號如TGF的感受性下降。穆紅等［7］使用p53cDNA的真核表達質(zhì)粒p53pcDNA3對人源性肝癌細胞系HepG2進行轉(zhuǎn)染，采用RNA原位雜交的方法證明了外源p53cDNA在HepG2p53細胞中的轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)錄，成功導(dǎo)入的p53cDNA可誘導(dǎo)HepG2細胞發(fā)生凋亡。p16基因也為抑癌基因，原發(fā)性肝癌中p16基因也常表現(xiàn)失活，p16基因能阻抑細胞生長于G1S期，但不誘發(fā)凋亡。p16啟動子甲基化后，肝癌發(fā)生概率明顯提高，尤其對于HBV感染者。

5抗血管生成基因治療

腫瘤血管生成是腫瘤生長轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟，是促血管生成因子和抑制因子作用失衡的結(jié)果。腫瘤血管生成是由腫瘤細胞和腫瘤浸潤炎癥細胞，如巨噬細胞或肥大細胞產(chǎn)生的促血管形成因子所介導(dǎo)的。惡性腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移依賴于新生血管的形成，為了不斷地獲得氧和養(yǎng)料，腫瘤細胞就要不斷的分泌促血管形成因子，不少細胞因子與腫瘤血管形成密切相關(guān)，因此，抑制腫瘤血管形成可以導(dǎo)致肝癌細胞衰退。腫瘤血管生成中最主要的是血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)。有試驗表明，用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)然反義RNA對抗血管內(nèi)皮生長因子，能夠抑制裸鼠的種植性肝癌的生長［8］。

6RNA干擾技術(shù)的應(yīng)用

RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術(shù)，也稱為基因沉寂療法，是利用雙鏈RNA(doublestranded RNA，dsRNA)誘發(fā)對宿主細胞特異性RNA轉(zhuǎn)錄的抑制，從抑制特異的基因表達的方法。利用 RNAi技術(shù)可同時阻斷多個癌基因的轉(zhuǎn)錄表達，從而有效抑制腫瘤的生長，達到治療腫瘤的目的。體外RNA干擾技術(shù)的主要特點在于其能利用細胞本身的成分，使外源重組干擾片斷能持續(xù)轉(zhuǎn)錄，同時能以一種類似酶促方式對目標mRNA進行切割，從而形成高效、穩(wěn)定而持久的干擾效應(yīng)。尿激酶型纖溶酶原激活劑(uPA)是一種在肝癌細胞中高表達的蛋白，參與機體的多種生理和病理過程，其表達水平與患者的生存呈負相關(guān)。李華等［9］構(gòu)建針對人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)基因siRNA真核表達載體pLXSNEGFPU6siTERT，以hTERT siRNA逆轉(zhuǎn)錄病毒為表達載體，感染HepG2細胞24、48、72 h后，端粒酶活性分別下降了23.84%、58.03%和85.01%( P＜0.05)，感染后24h細胞凋亡29.05%，肝癌細胞生長受到抑制，并存在一定量效和時效關(guān)系。除了上述介紹的六種比較經(jīng)典的基因治療方法外，近年又出現(xiàn)了一些新的基因治療方法。有專家設(shè)想利用超聲/微氣泡介導(dǎo)目的基因進入靶組織的靶胞內(nèi)［1011］，可以達到靶向性、可控性轉(zhuǎn)導(dǎo)基因治療的目的，有望成為有實用價值的臨床基因治療技術(shù)。不同的基因治療策略聯(lián)合應(yīng)用可相互協(xié)同，常采用免疫基因和自殺基因的聯(lián)合治療［12］，在增強機體抗腫瘤免疫能力同時直接殺傷腫瘤細胞，達到根治腫瘤的目的。

7展望

目前肝癌的基因治療策略已有很大發(fā)展，具有廣闊的應(yīng)用前景，而早期臨床證據(jù)和臨床實驗表明，基因作為一種藥物有重要的地位，將來的發(fā)展方向主要集中在下列幾方面：①尋找轉(zhuǎn)染效率高、基因容量高、毒性小的基因治療載體。近年來，利用超聲對比劑微泡作為基因載體并用超聲技術(shù)處理，提高轉(zhuǎn)染率已取得成功［1315］；②開發(fā)基因，實現(xiàn)可調(diào)控的基因轉(zhuǎn)染系統(tǒng)，以期提高在肝癌組織中的表達陽性率，進行更加精確的基因治療；③設(shè)計更具靶向性和安全性的基因轉(zhuǎn)運系統(tǒng)，尋找肝癌特異轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，從而使外源基因能夠持續(xù)、穩(wěn)定和特異表達，真正實現(xiàn)肝癌的基因治療從動物實驗轉(zhuǎn)向臨床應(yīng)用，將是肝癌基因治療的主要研究方向。盡管還存在很多需要解決的問題，但隨著分子生物學及相關(guān)學科的發(fā)展，我們相信肝癌的基因治療終將會廣泛地應(yīng)用于臨床。

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篇5

0引言

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis， UC)和克羅恩病(Crohns disease， CD)都屬于炎癥性腸病(inflammatory bowel disease， IBD)， 其發(fā)病可能由感染、遺傳、免疫等多種因素相互作用所致. 傳統(tǒng)觀念認為通過基因轉(zhuǎn)移替代缺陷基因的基因治療只適用于致病基因明確的疾病， 目前慢性炎癥性疾病和自身免疫性疾病也被納入了基因治療的范圍，可通過基因轉(zhuǎn)移使機體表達免疫相關(guān)蛋白質(zhì)， 從而下調(diào)致病的炎癥和免疫反應(yīng)， 上調(diào)保護性反應(yīng). 相對于囊性纖維化、重癥聯(lián)合免疫缺陷和腫瘤， IBD的基因治療尚處于起步階段. 本文就IBD的基因治療作一概述.

1IBD的免疫病理機制和腸干細胞

CD的腸黏膜炎癥以1型輔T細胞(Th1)型CD4+淋巴細胞占主導(dǎo)地位， 而UC則主要是由Th2型CD4+淋巴細胞介導(dǎo)的. 盡管CD和UC發(fā)生的機制并不完全相同，但最終的腸壁損傷均可歸咎于巨噬細胞、粒細胞等炎性細胞及其產(chǎn)生的炎性細胞因子. 一方面， 淋巴細胞、巨噬細胞在腸道局部聚集并釋放各種促炎細胞因子， 如TNFα，白細胞介素(IL)6，IL8，IL12，IL18等， 其中多數(shù)與疾病活動性呈正相關(guān); 另一方面， 抗炎細胞因子如IL10，IL4，轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)β等的分泌相對不足. 這種促炎細胞因子和抗炎細胞因子之間的失衡促進和加劇了腸壁的炎癥反應(yīng). 細胞因子失衡可由Th1/Th2細胞比例失衡引起， 又可反饋性地加重Th1/Th2細胞失衡， 形成惡性循環(huán)， 因此被視為IBD發(fā)病機制中的重要環(huán)節(jié). 腸上皮細胞不斷更新， 衰老的細胞脫落至腸腔， 新的細胞則由位于腸隱窩底部的干細胞不斷補充， 因此位于腸腺底部的干細胞成了基因治療的最佳靶細胞. 但是腸干細胞缺乏明確的形態(tài)學特征或理化特性， 目前還無法與其它腸上皮細胞鑒別， 因此無法直接證明目的基因已成功轉(zhuǎn)移至干細胞. 給予攜帶目的基因的載體后， 需要對干細胞成功地進行基因修飾， 腸上皮細胞才能持久穩(wěn)定地表達目的基因. 腺相關(guān)病毒(AAV)載體能使腸上皮細胞于口服感染后1 mo內(nèi)穩(wěn)定高效地表達目的基因. 予免疫缺陷鼠靜脈注射5型重組腺病毒(AD5)載體， 亦發(fā)現(xiàn)結(jié)腸上皮細胞長時間表達目的基因， 而消化道其他部位目的基因表達陰性. 腸道相關(guān)淋巴組織內(nèi)的免疫細胞無疑是IBD基因治療中最受關(guān)注的靶細胞， 但由于腸道黏膜上皮屏障的存在， 載體不能有效到達固有層. M細胞是存在于黏膜集合淋巴結(jié)濾泡頂部上皮中的一種特殊細胞， 其主要功能是將腸腔內(nèi)抗原和病原體跨上皮轉(zhuǎn)運至上皮下淋巴組織. 可利用M細胞能廣泛攝取各種抗原物質(zhì)的功能，及其與免疫細胞之間的對話方式， 通過M細胞將載體導(dǎo)入黏膜淋巴組織， 從而調(diào)節(jié)局部黏膜免疫反應(yīng)和機體的系統(tǒng)免疫反應(yīng)［1］. 有實驗表明AAV載體能感染腸道固有層內(nèi)細胞， 并使17%～19%的固有層細胞于感染后6 mo內(nèi)持續(xù)表達目的基因.

2目的基因轉(zhuǎn)移至胃腸道組織

實驗表明［2］， 阻斷小鼠肝動脈和門靜脈后， 經(jīng)眶后靜脈叢予重組腺病毒載體， 30 min后恢復(fù)肝臟血供， 腸壁血管、血管周圍組織和小腸絨毛持續(xù)表達目的基因達數(shù)周之久. 局部予經(jīng)包裝的質(zhì)粒、脂質(zhì)體、逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、腺病毒和AAV載體均能將目的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)至腸道黏膜，且黏液溶解劑(二硫蘇糖醇、N乙酰半胱氨酸)和蛋白酶體調(diào)節(jié)劑(MG101)能促進轉(zhuǎn)導(dǎo)效率. 上述載體中， 以AAV載體系統(tǒng)的應(yīng)用前景最廣闊. 重組AAV(rAAV)載體去除了所有編碼序列， 只保留145 bp的末端重復(fù)序列， 不含任何病毒基因， 感染細胞后，前病毒DNA定向整合至19號染色體的AAVS1區(qū)域. 在人類基因治療的常用病毒載體中， rAAV是目前唯一沒有引起宿主病理反應(yīng)的載體［3］. 實驗表明， 以AAV載體對空腹大鼠灌胃6 h后， 胃十二指腸和近端空腸固有層細胞開始表達目的基因， 并能持續(xù)穩(wěn)定表達6 mo; 雖然未觀察到結(jié)腸有目的基因表達， 但是可以推測灌腸能使目的基因被轉(zhuǎn)導(dǎo)至結(jié)腸固有層細胞. 此外， 雖然沒有直接證據(jù)表明AAV載體能感染腸干細胞， 但除固有層外， 腸上皮細胞亦表達目的基因1 mo. AD5是體內(nèi)實驗使用最多的載體， 該載體由于E1缺失造成病毒復(fù)制缺陷. 腺病毒載體可高效感染多種靶細胞， 對分裂期細胞和增殖停止期細胞均有很高的導(dǎo)入效率， 這是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體所不具備的. 據(jù)報道， 經(jīng)十二指腸飼管予大鼠E1缺失的重組腺病毒載體后， 目的基因能有效導(dǎo)入十二指腸、空腸和回腸上皮細胞. 以E1/E3缺失的重組腺病毒載體灌腸后， 結(jié)腸上皮細胞能高效表達目的基因. 而且炎癥性腸病的基因治療AD5載體感染IBD患者腸上皮細胞的效率遠高于非IBD患者［4］. 但是經(jīng)消化道予腺病毒載體主要感染的是更新速率很快的腸上皮細胞， 因此AD5載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的目的基因在腸道內(nèi)的表達時間只能維持數(shù)天， 為達到治療IBD的目的， 需反復(fù)給藥， 同時還要避免機體的免疫反應(yīng). 有報道稱， 經(jīng)尾靜脈注射重組腺病毒載體后， 免疫缺陷小鼠結(jié)腸上皮細胞和隱窩細胞可長時間表達目的基因， 而消化道其他部位無目的基因表達. 該實驗結(jié)果非常誘人，但由于E1缺失造成病毒復(fù)制缺陷， AD5載體不能像逆轉(zhuǎn)錄病毒載體一樣整合至宿主基因組.

3IBD基因治療的策略和研究現(xiàn)狀

3.1下調(diào)促炎細胞因子的表達IL18是一個多功能細胞因子， 結(jié)構(gòu)類似IL1家族， 能活化T淋巴細胞內(nèi)的核因子(NF)κB和激活蛋白(AP)1， 與IL12誘導(dǎo)的STAT4協(xié)同促進T 淋巴細胞表達干擾素(IFN)γ［5］. 此外， IL18還通過上調(diào)TNFα，IL6和IL1的表達加劇炎癥反應(yīng). 以IL18結(jié)合蛋白(IL18BP)治療三硝基苯磺酸(TNBS)誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎， 可減輕腸道炎癥. 鑒于IL18在CD中的重要作用， Wirtz等［6］嘗試以IL18為靶點對CD動物模型進行基因治療. 構(gòu)建表達IL18反義寡核苷酸的重組腺病毒載體， 予移植CD4+ CD62L+T淋巴細胞形成的CB.17SCID小鼠結(jié)腸炎模型灌腸. 蛋白質(zhì)印跡分析顯示表達IL18反義寡核苷酸的重組腺病毒載體能抑制結(jié)腸組織產(chǎn)生IL18， 實驗組結(jié)腸炎的內(nèi)鏡和組織病理學改變均較對照組明顯改善. 此外， 該實驗還觀察到局部給藥方式只抑制結(jié)腸固有層單核細胞產(chǎn)生IFNγ， 而不影響來源于脾臟的單核細胞.

3.2上調(diào)抗炎細胞因子的表達IL10能抑制巨噬細胞活化和分泌IL1α， ILβ， IL6， IL12， IL18和TNFα等細胞因子， 下調(diào)人類白細胞抗原(HLA) Ⅱ類分子的表達; 通過影響抗原遞逞細胞功能而強烈抑制CD4+ T淋巴細胞的增殖和分泌細胞因子. 此外， 其還能直接抑制T淋巴細胞產(chǎn)生IL2，TNF 和IL5. IL10基因敲除小鼠可自發(fā)形成Th1型淋巴細胞介導(dǎo)的結(jié)腸炎. IL10對IBD動物模型有效， 對CD患者的臨床實驗結(jié)果卻不令人滿意， 其原因可能是腸道局部IL10濃度過低， 起不到抑制炎癥的作用， 而加大劑量又會伴隨嚴重不良反應(yīng); 也可能是因為IL10半衰期太短所致. 一些研究小組嘗試以不同的給藥方式(灌腸、經(jīng)靜脈和經(jīng)腹腔) 評估AD5 IL10對IBD動物模型的預(yù)防和治療作用，結(jié)果顯示AD5 IL10能預(yù)防實驗性結(jié)腸炎的發(fā)生; 靜脈給藥的血IL10濃度顯著高于腹腔給藥，但并不能顯著提高結(jié)腸局部IL10濃度; 灌腸給藥的結(jié)腸局部IL10濃度高于靜脈給藥［7-10］. 雖然這些研究沒有得到預(yù)期的結(jié)果， 但至少證明以病毒載體表達細胞因子在IBD 基因治療中是可行的. 與IL10一樣， IL4也具有抑制巨噬細胞產(chǎn)生TNFα，IL1等促炎細胞因子的作用. 此外， 作為Th0細胞向Th2細胞分化的主要誘導(dǎo)因子， IL4可調(diào)節(jié)Th1/Th2細胞平衡，緩解結(jié)腸炎癥，但有研究［11］顯示IL4抗體能下調(diào)SAMP1/Yit鼠IFNγ的表達并明顯緩解腸道炎癥， 而移植分泌IL4的Th細胞可誘導(dǎo)SCID小鼠發(fā)生腸炎.

轉(zhuǎn)貼于 因此， IL4在腸道免疫中可能并非僅起抗炎作用， 其在人類IBD中的確切作用尚有待確定. TGFβ作為一種抗炎細胞因子在腸道免疫平衡中發(fā)揮重要作用， Kitani等［12］研究了TGFβ1質(zhì)粒在TNBS 誘導(dǎo)的結(jié)腸炎中的作用，結(jié)果顯示鼻內(nèi)一次給藥可預(yù)防和治療實驗性結(jié)腸炎， 而腹腔給藥無治療作用. 腸固有層和脾臟持續(xù)2 wk表達TGFβ1 mRNA， 并同時出現(xiàn)產(chǎn)生TGFβ1的T淋巴細胞和巨噬細胞， 且并不引起腸道、肺、脾、肝、腎發(fā)生纖維化. TGFβ除抗炎作用外， 在組織纖維化， 特別是病理性纖維化中也起重要作用. TGFβ1經(jīng)蛋白激酶C和細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2絲裂原活化蛋白激酶通路促進CD患者腸道成纖維細胞產(chǎn)生纖維連接蛋白、Ⅰ型膠原和結(jié)締組織生長因子［13］. Vallance等［14］以表達TGFβ1 的重組AD5載體灌腸， 導(dǎo)致小鼠結(jié)腸發(fā)生纖維化， TNBS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎惡化并加速腸壁纖維化進程.

4展望

基因治療為目前無法治愈的疾病提供了希望， 上述臨床前試驗為IBD的基因治療勾勒出了誘人的前景. 分子生物學的不斷發(fā)展將使高效、特異性地下調(diào)基因表達成為可能. RNA干擾是一種在生物體內(nèi)普遍存在的、在RNA水平調(diào)節(jié)基因表達的方式， 雙鏈RNA能高效、特異性地誘導(dǎo)與之同源的mRNA降解. 有報道稱局部給予針對TNFα的小干擾RNA能有效緩解膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎癥［15］. 綜上所述， 雖然IBD的基因治療研究已取得了令人鼓舞的成績， 但仍應(yīng)認識到基因治療在IBD中尚處于起步階段， 在應(yīng)用于臨床之前還有很長的路要走.

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篇6

原發(fā)性高血壓病是由遺傳與環(huán)境因素相互作用而導(dǎo)致的多基因遺傳病,遺傳因素對其發(fā)病的影響占30%～50%［1］。目前有關(guān)高血壓基因治療的研究很多,腎素血管緊張素系統(tǒng)（RAS）是研究的熱點之一。

1腎素血管緊張素系統(tǒng)

降低基因表達（亦稱反義基因療法）是指根據(jù)靶基因結(jié)構(gòu)特點設(shè)計反義寡核苷酸（AS-ODN）分子，導(dǎo)入靶細胞或機體后與雙鏈DNA或與mRNA結(jié)合形成雜合體，從而封閉或抑制升高血壓相關(guān)基因的復(fù)制或表達，以期達到降壓目的。RAS的過度活動是人類原發(fā)性高血壓及許多高血壓動物模型主要病理機制之一。目前腎素基因（REN）、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶基因(ACE)、AngⅡ1型受體（AT1R）和血管緊張素原基因(AGT)是RAS反義基因治療的主要靶點。

1.1腎素基因(REN)Wang等［2］將反義腎素核苷酸導(dǎo)入冷誘導(dǎo)高血壓（CIH）大鼠后降壓幅度達40mmHg，持續(xù)至少5周，并有效抑制了整個的RAS。

1.2血管緊張素轉(zhuǎn)化酶基因(ACE)Gelband 等［3］給新生自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）心內(nèi)注射ACE-AS，血壓降低(18±3)mmHg,且持續(xù)時間較長，其F1代大鼠也保持了這個水平。與高血壓發(fā)展相關(guān)的腎血管反應(yīng)性、電生理及鈣離子的動態(tài)平衡均得到改善，該研究還發(fā)現(xiàn)雖然ACE-AS對SHR的血壓下降程度不是很大，卻可以永久預(yù)防腎血管的病理性改變。Wang等［4］給SHR靜注逆轉(zhuǎn)錄病毒攜帶的ACE反義核苷酸，結(jié)果顯著降壓，并阻斷了高血壓引起的心、腎、血管病理改變。同時還發(fā)現(xiàn)ACE-AS被整合入親代基因組傳遞給子代，使子一代的血壓較對照組明顯降低，其心肌肥厚程度也有所改善。

1.3血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)1型受體(AT1R)基因Phyills等［5］以AT1R為靶目標研究反義基因治療的效果，向SHR的心內(nèi)注射攜帶有AT1R的反義cDNA的白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄載體(leukemia virus retroviral vector,LNSV)，可以觀察到39日齡大鼠的血壓顯著降低。Pachori等［6］以逆轉(zhuǎn)錄病毒將AT1R的ASODN轉(zhuǎn)染SHR,可使大鼠血壓持續(xù)下降。此外,用轉(zhuǎn)腎素基因大鼠建立高血壓及其相關(guān)心肌肥厚動物模型,以逆轉(zhuǎn)錄病毒將AT1R的ASODN一次性注入新生大鼠心肌中,結(jié)果發(fā)現(xiàn)該ASODN能長時間持續(xù)抑制AT1R在心血管組織中(包括心臟)的表達,雖然血壓未降至正常水平,但心肌肥厚程度明顯減輕。Hiromichi 等［7］研究發(fā)現(xiàn)，AT1R基因可以使血壓下降，并能逆轉(zhuǎn)心肌肥厚。

1.4血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)2型受體(AT2R)基因AT2R與AT1R介導(dǎo)的作用相反。Metcalfe等將以慢病毒為載體的AT2R cDNA導(dǎo)入SHR體內(nèi)，轉(zhuǎn)染21周后，SHR左心室壁厚度降低，心臟肥厚程度下降［8］。由慢病毒介導(dǎo)的AT2R在AngⅡ灌注高血壓大鼠模型中也具有抗肥厚和抗重塑作用。雖然血壓持續(xù)升高但AT2R轉(zhuǎn)染可以保護由高血壓引起的心臟損害［9］。

1.5血管緊張素原基因(AGT)Sugano等［10］將攜帶有AGT mRNA反義核苷酸的重組腺相關(guān)病毒載體(rAAV-AGT-AS)一次性注入5 d齡的SHR心肌中,結(jié)果發(fā)現(xiàn)高血壓發(fā)病推遲91 d,且大鼠在成年后血壓明顯降低,并持續(xù)6個月。重組腺相關(guān)病毒載體穩(wěn)定,且未見肝臟毒性作用發(fā)生。但AGT-AS不能將血壓完全降至正常水平，也不能完全逆轉(zhuǎn)血管重塑。

2RNA干擾(RNA interference)

RNA干擾(RNA interference,RNAi)是近年來新興的一種由雙鏈RNA誘發(fā)的“基因沉默”現(xiàn)象,能高效特異地阻斷靶基因的表達［11］。RNAi技術(shù)已廣泛應(yīng)用于抗病毒、抗腫瘤等與基因高度相關(guān)疾病的研究［12-14］。

Chen等［15］把腺病毒介導(dǎo)的AT，aR-shRNA注射入C57BL小鼠腦的背側(cè)迷走神經(jīng)核區(qū)域，發(fā)現(xiàn)夜間血壓明顯下降。何軍華等［16］用RNAi技術(shù)下調(diào)ACE表達，觀察其對SHR血壓及腎臟表達ACE的影響。研究顯示:Ads-EGFP-ACE-shRNA經(jīng)鼠尾靜脈注射后，可被主動脈、肺、心肌、腎臟組織良好吸收。SHR出現(xiàn)明顯的血壓下降，降壓作用至少可持續(xù)14 d之久，降壓的同時未引起心率的改變，并且這種效應(yīng)來源于單次給藥，較現(xiàn)有降壓藥物有明顯的優(yōu)勢。陳閩荔等［17］觀察應(yīng)用RNAi技術(shù)靶向基因沉默AT1R對腎性高血壓大鼠血壓及組織AT1R基因表達的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)注射rAAV-AT1R-shRNA 24 h后,收縮壓較注射前明顯下降(22.3±5.5) mmHg（P

孫成林等［18］實驗證實針對大鼠AT1R的mRNA設(shè)計的dsRNA質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)細胞,顯著降低靶基因mRNA和蛋白表達,實現(xiàn)了基因沉默,并可以拮抗AngⅡ所誘導(dǎo)的體外培養(yǎng)血管平滑肌細胞的增殖作用。張璞等［19］發(fā)現(xiàn)靶向大鼠AT1R基因mRNA的短發(fā)夾RNA腺病毒載體,在體外和體內(nèi)環(huán)境下高效特異性抑制靶基因的表達,能達到基因干擾目的。

張敬群等［20］以高腎素型高血壓模型Goldblatt兩腎一夾腎血管性高血壓大鼠模型為研究對象,用構(gòu)建的RNAi質(zhì)粒pAT1a-shRNA1或pAT1a-shRNA2單次尾靜脈注射,不僅阻斷了進行性的血壓升高趨勢,并有一定程度下降,有統(tǒng)計學意義。研究還發(fā)現(xiàn),RNAi質(zhì)粒能顯著抑制腎血管性高血壓導(dǎo)致的心肌肥厚、重構(gòu)，血管壁的重構(gòu)硬化得到顯著改善。

3問題與展望

高血壓的基因治療取得了令人矚目的成就，有著令人鼓舞的前景，但是目前高血壓病的基因療法尚處于動物實驗階段,尚未達到廣泛應(yīng)用于臨床這一既定目標，有許多問題仍然需要克服和解決。如靶基因的界定，基因轉(zhuǎn)錄的高效性、安全性、長效性問題、定向表達問題、給藥途徑問題、單一基因轉(zhuǎn)移為主的基因療法到多基因多因素多環(huán)節(jié)整體調(diào)節(jié)等。

但是隨著分子生物學技術(shù)迅猛發(fā)展，深入了解血壓及高血壓相關(guān)基因?qū)ρ獕旱恼{(diào)控機制，闡明人體組織器官生物學特性和疾病發(fā)展的病理生理過程，明確動物實驗和臨床研究的差距，相信基因治療能成為高血壓病治療的最佳有效途徑之一。

1）為天津市科委重點基金課題（No.09JCZDJC20600），課題名：中藥干預(yù)肝陽上亢型高血壓不同模型物質(zhì)基礎(chǔ)變化的機理

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篇7

【關(guān)鍵詞】 阿爾茨海默病;β淀粉樣蛋白;基因治療

阿爾茨海默病(AD)主要癥狀為進行性記憶力和認知力減退。目前，藥物治療仍是治療AD的主要手段，但現(xiàn)在所開發(fā)的藥劑多為化學合成藥，藥物作用位點不專一，特異性弱。相反，采用基因治療的方法不僅定位準確，作用持續(xù)時間長，而且沒有非靶器官的副作用，是一種較為理想的治療方法。此外，雖然研究證實AD是一種多病因介導(dǎo)的疾病，但是腦內(nèi)β淀粉樣蛋白(Aβ)代謝異常造成的Aβ片段聚集沉積引發(fā)的級聯(lián)反應(yīng)是AD的主要致病原因。Aβ的穩(wěn)態(tài)水平依賴于生成、清除和內(nèi)流間的平衡，因此，若能通過基因治療的手段減少Aβ生成或上調(diào)酶介導(dǎo)的Aβ降解，促進受體介導(dǎo)的Aβ腦外流，抑制Aβ腦內(nèi)流，便可有效地治療AD。

1 降低Aβ生成的基因治療

Aβ由分泌酶水解β淀粉樣前體蛋白(APP)產(chǎn)生。體內(nèi)有α、β、γ三種分泌酶參與APP的降解。α分泌酶的酶切位點位于APP蛋白中部，避免了完整Aβ分子序列的產(chǎn)生，且分解產(chǎn)生的可溶性淀粉樣前體蛋白α(soluble amyloid precursor protein α，sAPPα)對神經(jīng)細胞具有神經(jīng)營養(yǎng)和神經(jīng)保護作用，是正常人體內(nèi)APP的主要代謝方式;β分泌酶使APP裂解成游離的sAPPβ及仍結(jié)合在膜上的CTF99，CTF99再被γ分泌酶水解，生成P3和含有39～42個氨基酸殘基的Aβ，Aβ(尤其是Aβ40和Aβ42)聚集形成淀粉樣斑塊，產(chǎn)生神經(jīng)毒性。

1.1 APP基因 APP基因突變形成新的酶切位點，易為β、γ分泌酶(尤其是γ分泌酶)水解，進而產(chǎn)生大量的Aβ40和Aβ42，促進了淀粉樣斑塊的形成。用攜帶siRNA的單純皰疹病毒載體封閉APP突變基因的表達有效阻斷了AD小鼠海馬淀粉樣斑塊的形成〔1〕。

1.2 α分泌酶 α分泌酶及β、γ分泌酶兩個酶系統(tǒng)對同一底物APP進行競爭。如果α分泌酶活性增強，既生成了對細胞具有營養(yǎng)作用的sAPPα，又減少了Aβ的產(chǎn)生，因此提高α分泌酶的活性或表達，利于對AD的治療。

α分泌酶不是單一的蛋白酶，而是一類膜結(jié)合蛋白。金屬蛋白酶10(adisintegrin and metalloproteinase 10，ADAM10)具有α分泌酶的生物學功能。Colciaghi等〔2〕發(fā)現(xiàn)在AD患者中，ADAM10的水平降低，且隨疾病的進展，其下降程度增加。通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)，使AD模型小鼠神經(jīng)元中適度過表達ADAM10基因，sAPPα的分泌增加，淀粉樣斑塊的生成減少;相反，轉(zhuǎn)染ADAM10突變基因的AD模型小鼠，腦內(nèi)淀粉樣斑塊的沉積加劇〔3〕。這些結(jié)果在一定程度上提示了ADAM10對于AD具有潛在的治療作用。ADAM10并非唯一的α分泌酶，過表達ADAM9、ADAM17或ADAM19的細胞，sAPPα的分泌也增加。因此，它們也是α分泌酶的活性成分之一，但其在AD治療中的潛在作用還需要進一步的研究。

1.3 β分泌酶 1999年，Vassar等〔4〕用基因篩選的方法純化出一種新的、在β分泌酶位點剪切APP的蛋白酶，稱之為APP的β位點剪切酶(betasite APPcleaving enzyme 1，BACE1)。細胞實驗顯示，將化學合成的針對BACE1的siRNA轉(zhuǎn)染APP基因突變小鼠神經(jīng)元，干擾內(nèi)源BACE1基因的表達，Aβ的生成下降〔5〕。Kobayashi等〔6〕的研究也發(fā)現(xiàn)BACE1基因敲除的AD模型小鼠的大腦Aβ沉積顯著降低。構(gòu)建BACE1 siRNA的慢病毒表達載體，將載體注射到AD模型小鼠海馬中，小鼠海馬組織BACE1的表達顯著下降，Aβ的生成及淀粉樣沉積顯著降低，小鼠的行為學缺陷也得到一定改善〔7〕。

BACE2和BACE1同樣具有剪切APP的功能，但它主要在Aβ序列的19Phe20Phe和20Phe21Ala部位進行剪切，破壞完整Aβ的形成而具有了類似α分泌酶的作用。BACE2與BACE1相互拮抗，競爭同一作用底物APP，從而抑制Aβ的生成。用慢病毒載體介導(dǎo)BACE2基因轉(zhuǎn)染AD模型小鼠，BACE2在神經(jīng)元內(nèi)高表達，小鼠腦內(nèi)Aβ的沉積顯著降低〔8〕。

1.4 γ分泌酶 γ分泌酶是一組復(fù)雜的多亞基復(fù)合體，早老素(presenilin，PS)1和PS2為同源異構(gòu)體，是γ分泌酶的組分之一。PS1和PS2基因突變可使Aβ42的水平選擇性升高。APP、PS1和PS2基因突變被認為與早發(fā)型AD密切相關(guān)。除PS是γ分泌酶復(fù)合體組分外，還有Nicastrin(Nct)、APH1和PEN2，任一組分表達水平下調(diào)均將導(dǎo)致γ分泌酶復(fù)合體形成障礙。例如，用siRNA抑制細胞PS1的表達，γ分泌酶活性下降的同時，細胞中Aβ42的生成也顯著降低〔9〕。γ分泌酶的相關(guān)研究為AD基因治療提供了新的靶點，但其仍有待于深入的研究。

2 加速Aβ降解的基因治療

降解Aβ的酶有很多種，主要是腦啡肽酶(Neprilysin，NEP)、內(nèi)皮素轉(zhuǎn)化酶(endothelinconverting enzyme，ECE)和胰島素降解酶(insulin degrading enzyme，IDE，也稱insulysin)。此外，還有纖維蛋白溶酶(plasmin)、組織蛋白酶B(cathepsin B，CatB)等。

2.1 NEP NEP屬中性M13Zn金屬蛋白酶家族，是位于腦神經(jīng)軸突和突觸膜上的II型跨膜糖蛋白，主要在黑質(zhì)紋狀體通路表達，海馬和大腦皮質(zhì)也有表達。NEP的催化位點暴露在細胞外，是腦中細胞外不溶性Aβ的主要降解酶。NEP水平及活性的降低會導(dǎo)致Aβ的沉積，促使AD的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，隨年齡的增長，NEP的表達下降。AD患者大腦皮層和海馬處NEP的活性和水平也顯著降低〔10〕。用慢病毒載體、腺相關(guān)病毒載體或單純皰疹病毒載體將NEP基因?qū)階D模型小鼠腦中，顯著降低腦內(nèi)Aβ水平，減少淀粉樣斑塊的沉積，降低氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，抑制海馬和額葉的神經(jīng)病變，提高了AD小鼠的空間識別能力〔1，11〕。

2.2 ECE ECE也是M13Zn金屬蛋白酶家族的一員，參與腦內(nèi)Aβ的降解。細胞學研究顯示，抑制ECE的活性，Aβ的聚集增加;ECE過表達，Aβ的聚集減少。動物實驗研究顯示，ECE基因缺失的小鼠腦內(nèi)Aβ的水平升高〔12〕;相反，將表達ECE的重組腺相關(guān)病毒注射到AD模型小鼠大腦皮層及海馬中，注射部位Aβ水平顯著降低〔13〕。

2.3 IDE IDE位于神經(jīng)元細胞膜上，主要參與細胞內(nèi)可溶性Aβ單體的降解。隨年齡增長，腦IDE的水平逐漸下降。敲除IDE基因，小鼠腦中Aβ的降解下降，腦內(nèi)Aβ水平顯著升高。IDE基因缺陷也將導(dǎo)致AD患者皮層微血管Aβ累積，形成腦淀粉樣血管病變。通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)使AD模型小鼠腦IDE的表達增加了約2倍，顯著降低腦Aβ的水平，延遲或完全預(yù)防腦中淀粉樣斑塊的形成〔14〕。

2.4 Plasmin Plasmin介導(dǎo)的酶解過程除了在纖溶、細胞遷移等病理生理過程發(fā)揮作用外，也參與腦內(nèi)Aβ的降解。有活性的plasmin是由組織型纖溶酶原激活劑(tissue plasminogen activator，tPA)和尿激酶型纖溶酶原激活劑(urokinasetype plasminogen activator，uPA)催化沒有活性的血纖維蛋白溶酶原(plasminogen)而形成的。在AD模型小鼠腦中可見tPA和plasminogen共同表達于淀粉樣沉積部位，對Aβ42降解起到了重要的作用。但在plasmin基因敲除小鼠腦中并未觀察到內(nèi)源性Aβ水平的升高，推測plasmin可能在Aβ聚集發(fā)生以后才發(fā)揮降解作用〔15〕。在AD患者或AD模型動物腦內(nèi)，plasmin的表達與正常個體相比均顯著降低。而用uPA或tPA和plasminogen聯(lián)合應(yīng)用均可顯著降低AD模型小鼠腦內(nèi)Aβ的沉積及淀粉樣斑塊的形成，為治療AD提供了新的策略〔16，17〕。

2.5 CatB CatB也可以降解Aβ，尤其是Aβ42。抑制AD模型小鼠CatB基因的表達，Aβ42的表達升高，淀粉樣沉積加劇。用慢病毒介導(dǎo)CatB基因轉(zhuǎn)染老年AD模型小鼠，顯著降低了已有的Aβ沉積〔18〕。CatB具有抗淀粉樣沉積和保護神經(jīng)作用。

3 加速Aβ轉(zhuǎn)運的基因治療

腦內(nèi)Aβ的轉(zhuǎn)運清除包括血腦屏障(bloodbrain barrier，BBB)轉(zhuǎn)運和經(jīng)非特異性腦間質(zhì)液泵流到腦脊液后進入血液清除。腦內(nèi)絕大多數(shù)的Aβ是經(jīng)BBB途徑轉(zhuǎn)運出腦，10%～15%的Aβ由腦間質(zhì)液泵流清除?？扇苄訟β通過BBB，是由受體介導(dǎo)的跨膜轉(zhuǎn)運完成的：低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白(LRP)和P糖蛋白(Pgp)介導(dǎo)可溶性Aβ由腦轉(zhuǎn)運至血液，進而轉(zhuǎn)移至肝臟降解;晚期糖基化終產(chǎn)物受體(RAGE)介導(dǎo)Aβ經(jīng)血液由外周轉(zhuǎn)運至大腦。

3.1 LRP 胞外可溶性Aβ與血管內(nèi)皮細胞表達的LRP結(jié)合，經(jīng)轉(zhuǎn)胞作用過BBB進入血液循環(huán);腦內(nèi)可溶性Aβ通過腦間質(zhì)液進入腦脊液同樣需要LRP的介導(dǎo);血清中還存在一種可溶性的LRP(sLRP)可以結(jié)合血清中70%～90%的Aβ，抑制血液中的Aβ進入腦內(nèi)。AD患者或AD模型小鼠腦微血管LRP的表達與正常個體相比顯著降低〔19〕。LRP基因缺失或表達量降低，造成AD模型小鼠腦Aβ沉積加劇，神經(jīng)功能損傷加強。因此，增加血管內(nèi)皮細胞LRP的表達或外周血液sLRP的含量，可有效降低腦中Aβ的積聚，為臨床治療AD提供了一條新的途徑。2007年，Sagare等〔20〕利用重組型sLRPIV對AD模型小鼠進行治療，顯著降低了血管壁和腦中Aβ的沉積，改善了AD小鼠的學習記憶能力。

3.2 Pgp Pgp是一種膜結(jié)合蛋白，屬于轉(zhuǎn)運蛋白ATP結(jié)合物(ABCT)超家族成員之一，由MDR1基因編碼。Pgp分布廣泛，在擔負重要生物屏障作用的腦毛細血管內(nèi)皮細胞和腸上皮細胞中呈高表達。Pgp與多藥耐藥的產(chǎn)生關(guān)系非常密切，也參與腦脊液及BBB處的Aβ轉(zhuǎn)運，介導(dǎo)Aβ的腦外流。Aβ40或Aβ42和Pgp相作用經(jīng)囊泡轉(zhuǎn)運出細胞。將Aβ40和Aβ42顯微注射到Pgp基因缺失小鼠腦中，Aβ從腦內(nèi)的清除速率與野生型小鼠相比下降了50%。抑制AD模型小鼠Pgp的活性，腦間質(zhì)液中Aβ的水平在數(shù)小時內(nèi)就有顯著升高。敲除AD模型小鼠Pgp基因，腦內(nèi)Aβ水平升高，Aβ的沉積加劇〔21〕。因此，增加Pgp的表達，促進Aβ的腦外流，降低腦內(nèi)Aβ的水平，為治療AD提供了又一可能，但目前尚未見此類報導(dǎo)。

3.3 RAGE RAGE是一種多功能的細胞表面受體，屬于免疫球蛋白家族，分胞外域、跨膜域和胞內(nèi)域。AD患者腦中過度的Aβ數(shù)量可上調(diào)RAGE的表達。腦微血管內(nèi)皮細胞RAGE表達的升高，使RAGE介導(dǎo)的Aβ腦內(nèi)流更加顯著，加重了神經(jīng)功能障礙;Aβ與小膠質(zhì)細胞表達的RAGE相作用，促進前炎癥因子的釋放，導(dǎo)致持久的慢性神經(jīng)炎癥反應(yīng)的發(fā)生;Aβ和神經(jīng)元上的RAGE結(jié)合還將導(dǎo)致神經(jīng)元存活率的下降〔22〕。Arancio等〔23〕通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)使AD小鼠腦中表達的RAGE缺乏胞內(nèi)域，不能觸發(fā)細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，緩解了Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)功能損傷，使AD小鼠的學習記憶力得到了部分保留，神經(jīng)病理表現(xiàn)也較輕微。此外，機體內(nèi)還有一種RAGE缺乏跨膜域和胞內(nèi)域，僅具備胞外域，可由細胞分泌出來進入血液循環(huán)，形成可溶性RAGE(sRAGE)，sRAGE與全長RAGE競爭和血液中的Aβ結(jié)合形成sRAGEAβ復(fù)合物，但是sRAGE不能穿過血腦屏障，抑制了Aβ的腦內(nèi)流，從而間接抑制了RAGE的功能。目前，Deane等〔24〕將通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得的sRAGE對AD模型小鼠連續(xù)注射3個月，小鼠表現(xiàn)出較正常的空間識別和學習能力。

4 總結(jié)與展望

由于世界范圍人口老齡化，AD發(fā)病率的日益上升，研制與開發(fā)安全有效的治療方案面臨巨大挑戰(zhàn)?；蛑委熞云涮禺愋詮姟⒆饔脮r間長、療效好和副作用低等優(yōu)勢具有廣闊的發(fā)展前景。目前，部分基因治療在嚙齒類和靈長類動物中已被證明安全有效，對人類的治療正進入臨床試驗階段，進一步臨床研究正在進行中〔25，26〕。Aβ代謝相關(guān)基因更是因為其和AD的發(fā)展密切相關(guān)，越來越受到人們的關(guān)注，很有可能在不久的將來Aβ代謝相關(guān)的基因治療會成為治療AD的主要手段。

但要把基因治療真正應(yīng)用于臨床，還需要克服許多技術(shù)上的困難和障礙。例如，攜帶目的基因的病毒載體本身會引起機體抗病毒的免疫反應(yīng)，從而對組織器官產(chǎn)生損害。此外，上調(diào)或抑制Aβ代謝相關(guān)基因的表達，雖然可以治療和預(yù)防AD，但這些基因產(chǎn)物除了參與Aβ代謝外，還參與其他的生理功能，其表達水平改變給治療帶來的副作用也不容忽視。例如：(1)敲除BACE1基因的AD模型小鼠，Aβ的沉積有所減少，但把正常小鼠的BACE1基因敲除，出現(xiàn)了意想不到的感覺運動障礙，空間記憶力衰退等癥狀。因此BACE1除了誘導(dǎo)Aβ的生成，其在正常的學習、記憶和感覺運動過程中也發(fā)揮著一定的作用〔27〕。(2)在封閉γ分泌酶表達的同時，還可能會影響到一些重要信號通路的傳導(dǎo)(如Notch)。Notch為一膜蛋白受體，其介導(dǎo)的信號途徑與胚胎發(fā)生、造血及神經(jīng)干細胞分化、發(fā)育有關(guān)，因此有可能會帶來一些嚴重的副作用。(3)除Aβ外，NEP還有很多作用底物，持續(xù)的NEP激活也會對機體造成傷害。例如，過表達NEP可以降低AD模型果蠅腦內(nèi)Aβ42的沉積和神經(jīng)元損傷，但同時也引發(fā)了年齡依賴的軸突衰退，使果蠅的壽命縮短了一半〔28〕。(4)臨床上ECE抑制劑常被用于治療高血壓病，若上調(diào)ECE水平，有可能導(dǎo)致患者血壓升高。(5)過多的plasmin的生成，易造成細胞連接降低。(6)LRP除介導(dǎo)Aβ的腦外流，還促進APP和BACE1發(fā)生相互作用，導(dǎo)致Aβ生成增加〔29〕。因此，研制更安全的病毒載體，選擇性地提高或抑制Aβ代謝相關(guān)基因中與Aβ代謝相關(guān)結(jié)構(gòu)域的表達將會成為AD基因治療研究的重點。若這些問題能得到妥善解決，相信AD的徹底治療也就為期不遠了。

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篇8

【關(guān)鍵詞】脂聯(lián)素;脂聯(lián)素受體;內(nèi)皮細胞;保護作用;基因治療

糖尿病大血管病變是糖尿病患者致死、致殘的最主要原因之一。脂聯(lián)素(adiponectin)脂肪細胞分泌的具胰島素增敏作用的細胞因子,對血管內(nèi)皮細胞有著潛在的保護作用。與其他脂肪因子不同,在肥胖患者及肥胖相關(guān)疾病,如動脈粥樣硬化、2型糖尿病、血脂代謝異常中,脂聯(lián)素的水平往往是降低的。相反,提高血漿脂聯(lián)素水平,可有效地降低血管并發(fā)癥的發(fā)生。載脂蛋白E缺陷小鼠的球狀脂聯(lián)素轉(zhuǎn)基因表達的動物模型顯示:球狀脂聯(lián)素可改善載脂蛋白E缺陷小鼠的動脈粥樣硬化病變。故深入對脂聯(lián)素的血管保護作用機制的研究,有助于為糖尿病大血管病變的防治提供新的思路。

1脂聯(lián)素及其受體概述

脂聯(lián)素,亦稱apM1(脂肪組織最豐富的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物)、GBP28(28KDa凝膠結(jié)合蛋白)、Acrp30(30KDa脂肪補體相關(guān)蛋白)等,是由脂肪細胞特異性分泌的具有244個氨基酸的多肽,包括N端信號肽、氨基端非螺旋功能區(qū)、膠原結(jié)構(gòu)域以及C端球形結(jié)構(gòu)域(gAcrp)。人脂聯(lián)素定位于染色體3q27處糖尿病及心血管疾病的易感位點。脂聯(lián)素因其具有改善胰島素抵抗、抗動脈粥樣硬化、降血糖、血脂、抗炎、抗氧化等作用而成為當前研究的熱點。

2003年6月Yamauchi等克隆了脂聯(lián)素受體(Adiponectinreceptor,AdipoR)AdipoR1與AdipoR2后,AdipoR也成了新的研究熱點,2004年Hug同樣用分子克隆技術(shù)得出結(jié)論T鈣粘蛋白(Tcadherin)是脂聯(lián)素的一種新受體,且Tcadherin是脂聯(lián)素六聚體和高分子質(zhì)量多聚體的受體,不與脂聯(lián)素球狀結(jié)構(gòu)域、脂聯(lián)素三聚體結(jié)合。

2脂聯(lián)素的胰島素樣血管活性作用

脂聯(lián)素的胰島素樣血管活性作用是指脂聯(lián)素可致內(nèi)皮依賴性血管舒張,主要體現(xiàn)在脂聯(lián)素對血管舒張因子一氧化氮(NO)生成的影響。

內(nèi)皮源性NO通過增強血管舒張、抑制血小板聚集、單核細胞黏附以及血管平滑肌細胞增殖等作用而對血管系統(tǒng)起著保護作用。脂聯(lián)素可以通過以下三個方面影響內(nèi)皮細胞NO的生成,從而保護血管內(nèi)皮細胞。第一,AMPKPI3KAKTeNOS途徑:AdipoR1與AdipoR2都在人臍靜脈表達。脂聯(lián)素作用于其受體后,可激活A(yù)MPK,AMPK再活化eNOS?；罨痚NOS的過程依賴于絲/蘇氨酸激酶(Akt)的活化,其中Akt與其上游磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)信號通路相連。因而通過上述途徑,脂聯(lián)素有益于血管內(nèi)皮NO的產(chǎn)生,從而保護內(nèi)皮功能;第二,接頭蛋白APPL1對NO生成的影響。接頭蛋白APPL1是AMPK的上游信號分子,新近研究表明,脂聯(lián)素與其受體的結(jié)合將促進接頭蛋白APPL1與AdipoR1、AdipoR2的胞質(zhì)尾區(qū)相互作用。而通過RNA干擾抑制人臍靜脈內(nèi)皮細胞APPL1的表達,將減弱脂聯(lián)素誘導(dǎo)的AMPK第172位蘇氨酸位點和eNOS第1177位絲氨酸位點的磷酸化激活,也減弱eNOS和HSP90復(fù)合物的形成,最終導(dǎo)致NO產(chǎn)量的明顯下降。可見APPL1介導(dǎo)脂聯(lián)素誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞NO產(chǎn)量和內(nèi)皮依賴性血管舒張;第三,抑制NADPHOxidaseRos途徑,一項在主動脈內(nèi)皮細胞進行的研究提示,球形脂聯(lián)素可通過抑制NADPH氧化酶(NADPHOxidase)的活性,抑制氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)誘導(dǎo)的反應(yīng)性氧化產(chǎn)物(ROS)的產(chǎn)生,從而恢復(fù)eNOS的活性并減少NO的破壞。

3脂聯(lián)素的抗炎、抗氧化作用

3.1脂聯(lián)素的抗炎作用現(xiàn)在已知的與內(nèi)皮細胞作用相關(guān)的物質(zhì)有:自由脂肪酸,細胞因子如腫瘤壞死因子(TNFα),以及氧化強化劑分子如氧化修飾型低密度脂蛋白(oxLOL)等。這些物質(zhì)激活信號激酶,也與活性氧(ROS)密切相關(guān)。代謝綜合征和糖尿病就根源于ROS主導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。目前發(fā)現(xiàn)脂聯(lián)素對血管功能和炎癥細胞都有直接影響,在動脈粥樣硬化早期,炎癥因子如TNFα能激活產(chǎn)生黏附分子,從而使單核細胞與血管內(nèi)皮細胞黏附。脂聯(lián)素可抑制TNFα誘導(dǎo)的細胞黏附分子(如VCAM1,E選擇素,ICAM1)在人主動脈內(nèi)皮細胞表面表達,脂聯(lián)素通過激活環(huán)磷酸腺苷(cAMP)蛋白激酶A(PKA)信號通路,抑制TNFα介導(dǎo)的核因子κB(NFκB)的抑制分子(IκBα)的快速磷酸化及降解,從而抑制NFκB的活化,來減輕內(nèi)皮細胞的炎癥反應(yīng)。脂聯(lián)素還可減少TNFα誘導(dǎo)的人主動脈內(nèi)皮細胞中的IL8的表達水平。此外,脂聯(lián)素的抗炎癥效果還包括抑制白細胞聚集、減輕噬菌細胞的活性以及降低巨噬細胞TNFα的分泌水平。

3.2脂聯(lián)素的抗氧化作用不斷增加的氧化應(yīng)激是肥胖和糖尿患者血管機能障礙的致病基礎(chǔ)。臨床研究也表明,血漿脂聯(lián)素水平與反應(yīng)氧標記物呈負相關(guān)。

當?shù)兔芏戎鞍?LDL)顆粒在血管壁處吸收并氧化,可以促進泡沫狀細胞的形成,遏制內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)的活性,引起炎癥反應(yīng)并刺激活性氧(ROS)的產(chǎn)生,從而最終導(dǎo)致動脈粥樣硬化的形成。利用大動脈內(nèi)皮細胞進行研究,結(jié)果表明脂聯(lián)素(gad)能夠抑制oxLDL誘導(dǎo)的細胞增殖、過氧化物的釋放和對有絲分裂原激活蛋白激酶(p42/p44MAPK)的活化,對內(nèi)皮起到抗氧化作用。較新的一項研究亦表明,脂聯(lián)素可通過cAMP/PKA途徑,抑制高糖狀態(tài)下的內(nèi)皮細胞反應(yīng)氧的產(chǎn)量,從而發(fā)揮血管內(nèi)皮保護作用。

4抗動脈粥樣硬化

動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展的兩個主要機制是:一,單核細胞在細胞黏附因子的作用下黏附于血管內(nèi)皮,分化為巨噬細胞,然后轉(zhuǎn)化成泡沫細胞;二,內(nèi)膜增厚,中層平滑肌細胞增生并遷移至內(nèi)膜下。脂聯(lián)素通過對這兩個過程的干預(yù),進而發(fā)揮抗動脈粥樣硬化的作用。

脂聯(lián)素通過對這兩個機制的干預(yù),起到抗動脈粥樣硬化的作用。第一,脂聯(lián)素通過減少黏附分子在血管內(nèi)皮細胞上的表達來抑制單核細胞對內(nèi)皮細胞的黏附;通過減少血管內(nèi)膜下巨噬細胞清道夫受體的表達和脂質(zhì)的積聚來抑制其向泡沫細胞的轉(zhuǎn)變;第二,脂聯(lián)素可抑制諸如成纖維細胞生長因子、表皮樣生長因子、血小板源性生長因子BB等致動脈粥樣硬化生長因子介導(dǎo)的人主動脈平滑肌細胞的增殖和向內(nèi)膜下的遷移[14]。類似地,一項新近的研究也表明,脂聯(lián)素可抑制由血小板源性生長因子BB誘導(dǎo)的載脂蛋白E缺陷小鼠肺主動脈平滑肌細胞的增殖。脂聯(lián)素的抗平滑肌增殖的作用可能是由于其與那些生長因子的結(jié)合,從而阻斷了生長因子與它們相應(yīng)的膜受體的結(jié)合。

5脂聯(lián)素對內(nèi)皮保護的相關(guān)基因治療研究

脂聯(lián)素的基因治療目前處于體外細胞轉(zhuǎn)染和體內(nèi)動物實驗的階段,通過載體將脂聯(lián)素基因輸入細胞或體內(nèi),使其表達,從而達到研究目的。

篇9

【關(guān)鍵詞】 pUDKH基因；血管；肌肉；組織病理

【Abstract】 AIM: To observe the effects of pUDKH administration locally on blood vessels and muscles in dogs with hindlimb ischemia. METHODS: Dogs were anesthetized with an intravenous injection of sodium pentobarbital (30 mg/kg). Then the left external iliac artery as well as all of the above arteries were ligated completely with silk thread. Thus the completely ischemic hindlimb model was established. The dogs with completely ischemic hindlimb were randomly pided into 2 groups: control group (control vector pUDK) and HGF transferred group (pUDKH)， 4-6 dogs each. Then pUDKH or pUDK was injected directly into the left ischemic limb muscles. Three months (90 d) after injection， left external iliac arteriography was performed， blood flow rate of the left femoral artery was quantified and the temperature of distal muscle in hindlimb was measured. At the same time，the left femoral artery and femoral around muscles at the sites of injection of pUDKH and pUDK plasmids were removed and stained with HE to observe their histopathological changes by light microscopic examination. RESULTS: The degree of augmentation of collateral vessel formation was significantly greater than that treated by control vector in hindlimb ischemia models. In addition， the blood flow rate of femoral artery in dogs treated with pUDKH was recovered on day 90， while the flow rate was only 1/5 to 1/3 in control dogs. Degeneration and breakage of muscle fibers and edema among muscle bundles were observed in ischemic limb of control dogs， but in ischemic hindlimb transfected with pUDKH， no significant pathological changes were found. For control dogs， collapse of the left femoral artery， thickening of vessel wall and stenosis even occlusion of small blood vessel among muscle bundles were observed， few new blood vessels were found. But in pUDKH dogs， above all were almost normal. CONCLUSION: pUDKH has a protective effect on blood vessels and muscles in dogs with hindlimb ischemia.

【Keywords】 pUDKH；artery；muscle；histopathology

【摘要】 目的: 觀察pUDKH(攜帶肝細胞生長因子基因的質(zhì)粒)基因治療犬下肢缺血后對其血管和肌肉組織病理學的影響. 方法: 雜種犬在靜脈內(nèi)注射苯巴比妥鈉麻醉下，于左后側(cè)腹股溝在股動脈由髂外動脈分支處的起始端進行全結(jié)扎，造成肢體缺血模型. 模型犬被隨機分為對照組和pUDKH處理組，并在結(jié)扎后即刻分別注射pUDK（空白質(zhì)粒）或pUDKH. 于手術(shù)后3 mo，行左髂外動脈造影術(shù)，測定股動脈血流量和下肢遠端局部溫度，并從被結(jié)扎的后肢股動脈及內(nèi)外側(cè)肌肉取組織標本，經(jīng)常規(guī)組織病理切片染色，光學顯微鏡下觀察. 結(jié)果: 3 mo時血管造影pUDKH組可見明顯血管網(wǎng)的形成，而轉(zhuǎn)移空質(zhì)粒的對照組僅見少量新生血管；此時轉(zhuǎn)移pUDKH組犬股動脈血流量已恢復(fù)到結(jié)扎前的水平，而對照組股動脈血流量僅為結(jié)扎前的1/5~1/3；轉(zhuǎn)移pUDKH組結(jié)扎側(cè)肌肉溫度與健側(cè)相比無明顯差異，而對照組兩肢體肌肉溫度卻相差1~2℃. 組織學觀察對照犬可見結(jié)扎點遠端股動脈塌陷，肌束間動脈管壁變厚，管腔變小甚至消失，少見新生的小血管；pUDKH處理組犬結(jié)扎點遠端股動脈管腔開放，肌束間小動脈壁均普遍未見增厚，管腔亦未縮??；對照犬結(jié)扎側(cè)肌纖維變性、斷裂、肌束內(nèi)水腫、脂肪性變，pUDKH處理組結(jié)扎側(cè)的肌肉組織中上述病變不明顯. 結(jié)論： pUDKH的局部注射對犬下肢缺血后血管和肌有保護作用.

【關(guān)鍵詞】 pUDKH基因；血管；肌肉；組織病理

0引言

下肢缺血主要是血栓閉塞性脈管炎或糖尿病性下肢中小血管病變、周圍神經(jīng)病變等所造成的下肢慢性缺血，涉及血管、神經(jīng)、肌肉等組織的病變，當病變進展而減少了動脈的橫截面積至80%或更多時，患者表現(xiàn)間歇性跛行、功能障礙，甚至肢體壞死（壞疽）. 目前對此尚無理想的藥物治療方法，最終需行截肢手術(shù)而致殘，預(yù)后較差［1-4］. 近年來基因治療為其開辟了一條新的途徑，通過合適的載體介導(dǎo)，轉(zhuǎn)移促血管生長因子的基因于缺血組織，可促進新血管在局部的產(chǎn)生，形成血管“網(wǎng)”和血管“橋”，建立“分子搭橋”機制.

人肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor， HGF）是一多功能生長因子，除促進血管新生外［4］，對器官/組織的損傷有一定的修復(fù)作用［5］，包括肌肉、神經(jīng)等. 本文利用犬后肢結(jié)扎股動脈造成血管閉塞性疾病的動物模型，采用股動脈周圍骨骼肌肉內(nèi)多點注射攜帶HGF基因的裸質(zhì)粒pUDKH方法，探討其治療犬肢體缺血時對其血管和肌肉組織病理學的影響，為局部pUDKH基因治療的實際應(yīng)用提供實驗依據(jù).

1材料和方法

1.1材料

動物：河北地區(qū)草狗18只，雄性，年齡為1.5~3歲，體質(zhì)量12~15 kg，由軍事醫(yī)學科學院動物實驗中心提供. pUDKH: 攜帶人肝細胞生長因子基因的重組裸質(zhì)粒， pUDK: 未攜帶人肝細胞生長因子基因的空質(zhì)粒， 軍事醫(yī)學科學院放射醫(yī)學研究所三室提供.

1.2方法

1.2.1動物模型的建立犬經(jīng)15 g/L戊巴比妥鈉靜脈麻醉（30 mg/kg）后. 在無菌條件下分離左側(cè)髂外動脈遠端及分支和股動脈近端，將髂外動脈遠端及股動脈分支全部結(jié)扎，造成左下肢血管完全閉塞性血管病模型. 在股動脈處安置血流量計探頭，左外側(cè)肌肉插入THRNST針型體溫度電極，測定股動脈完全閉塞前、后10 min內(nèi)股動脈血流量及左、右外側(cè)肌肉溫度，以判斷左側(cè)髂外動脈遠端已完全閉塞. 右側(cè)下肢動脈不予結(jié)扎.

1.2.2基因轉(zhuǎn)移將模型動物隨機分為4組：模型對照組（給予不攜帶HGF基因的空質(zhì)粒pUDK 0.30 mg/kg (6只），pUDKH 0.15 mg/kg組(4只)，pUDKH 0.30 mg/kg組(4只)和pUDKH 0.60 mg/kg組(4只). 按每公斤體質(zhì)量給犬的藥量，將pUDK或pUDKH稀釋在1 mL生理鹽水中，于手術(shù)后10 min內(nèi)，在左大腿肌內(nèi)側(cè)注射3點，左大腿肌外側(cè)注射2點，每點注射體積為0.2 mL，最后逐層關(guān)閉傷口. 以后的飼養(yǎng)過程中不再進行基因轉(zhuǎn)移.

1.2.3動脈血管造影每組全部犬的術(shù)后90 d，于右側(cè)股動脈內(nèi)插管行至髂總動脈端，行左髂外動脈造影術(shù)，導(dǎo)管尾端連接一高壓注射器快速注入泛影葡胺，拍攝X光片以觀察新生血管和側(cè)支循環(huán)的形成情況.

1.2.4股動脈血流量及肢體溫度測定在術(shù)前和術(shù)后0 d，90 d各測定股動脈血流量和下肢遠端局部溫度一次.

1.2.5組織病理學檢查于手術(shù)轉(zhuǎn)基因后3 mo，從結(jié)扎的后肢股動脈及內(nèi)與外側(cè)肌肉取組織標本，經(jīng)常規(guī)組織病理切片染色，光學顯微鏡下觀察.

統(tǒng)計學處理： 實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 10.0軟件分析. 實驗數(shù)據(jù)以x±s表示，用方差分析法及LSDt檢驗比較各給藥組與對照組的差異，組內(nèi)左、右比較采用配對t檢驗. P

2結(jié)果

2.1血管

2.1.1轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pUDKH可明顯促進缺血肢體血管網(wǎng)的建立股動脈完全結(jié)扎后，轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pUDKH組于結(jié)扎后即刻進行血管造影便可見到血流完全阻斷，90 d時有明顯的新生血管和血管網(wǎng)形成. 這些新生血管和血管網(wǎng)形成后，從股動脈結(jié)扎點到股動脈遠端由許多小血管網(wǎng)連接，從而使髂外動脈灌注到結(jié)扎點遠端股動脈血流運行通暢（圖1A）. 單純轉(zhuǎn)移空質(zhì)粒

A： pUDKH組，轉(zhuǎn)移pUDKH 0.30 mg/kg后第90日；B： 對照組，轉(zhuǎn)移空質(zhì)粒pUDK 0.30 mg/kg后第90日， 箭頭所示為結(jié)扎部位.

(pUDK)的對照組，90 d的新生血管數(shù)顯著少于轉(zhuǎn)移pUDKH基因組，股動脈結(jié)扎點以下的動脈全部消失(圖1B). 轉(zhuǎn)移pUDKH 0.15，0.30，0.60 mg/kg三個劑量組之間差別不明顯，0.60 mg/kg組比其他2個給藥組更容易使髂外動脈結(jié)扎點到股動脈接點縮短.

轉(zhuǎn)染pUDKH的三個劑量組在/100 cm2骨骼肌內(nèi)、外側(cè)和皮膚中血管數(shù)明顯比模型對照組多，差別非常明顯. 與未手術(shù)的右下肢骨骼肌內(nèi)、外側(cè)和皮膚比較，無明顯的差異. 轉(zhuǎn)pUDKH基因大、中、小劑量組犬骨骼肌組織之間的血管數(shù)與健康肢骨骼肌組織血管數(shù)相差不明顯(表1).表1左下肢內(nèi)、外側(cè)骨骼肌和皮膚血管數(shù)的變化(略)

2.1.2股動脈血流量及肢體溫度測定髂外動脈完全結(jié)扎后即刻，股動脈血流量從平均(41.50±5.99) mL/min，下降為0，隨著術(shù)后飼養(yǎng)時間的延長，模型對照組下肢股動脈血流有所增加，術(shù)后90 d比術(shù)后即刻增加了7 mL/min. 而轉(zhuǎn)染pUDKH的3個劑量組在術(shù)后90 d，結(jié)扎側(cè)股動脈流量已經(jīng)恢復(fù)到術(shù)前的水平(表2).表2轉(zhuǎn)染pUDKH后股動脈血流量（略）的變化

轉(zhuǎn)染pUDKH后90 d犬左側(cè)下肢肌肉溫度與健側(cè)肌肉溫度無明顯差異，而模型對照組左右后肢肌肉溫度相差1~2℃(表3).表3轉(zhuǎn)染pUDKH后左側(cè)肢體溫度的變化(略)

2.1.3股動脈形態(tài)對照犬有的股動脈仍處于塌陷狀態(tài)，致使管腔幾乎完全消失（圖2A）；pUDKH 處理犬股動脈的橫截面上可見內(nèi)彈力板完整，有的管腔已伸展完全，可與正常犬者相當（圖2B）.

2.1.4肌束間血管形態(tài)對照犬肌束間小動脈管壁變厚、管腔變小甚至消失，且肌束間或肌外衣下纖維組織中也罕見新生的小血管. 中等大小動脈管腔亦變小、管壁變厚（圖3A）. pUDKH處理犬除個別者外，肌束間小動脈壁均普遍未見增厚，管腔亦未縮小. 此外，肌束間或肌外膜下的結(jié)締組織中常含有較多的新鮮紅細胞（圖3B）.

2.2肌肉形態(tài)對照犬觀察到結(jié)扎側(cè)肌纖維變性、橫紋不清晰；肌纖維及細胞核變細、斷裂、染色淡，肌束內(nèi)水腫，以及出現(xiàn)脂肪（圖4A）. pUDKH處理犬經(jīng)各劑量處理的結(jié)扎側(cè)的肌肉組織中上述病變均已不很明顯（圖4B）.

3討論

在實驗中，經(jīng)活體股動脈血管造影已清楚地觀察到，pUDKH處理組犬使結(jié)扎側(cè)肢體比用不攜帶HGFA： 對照組，轉(zhuǎn)移空質(zhì)粒pUDK后第90日，示肌束內(nèi)及肌束間中小動脈管壁變厚，管腔變小，甚至幾盡消失; B：pUDKH組，轉(zhuǎn)移pUDKH（0.30 mg/kg）后第90日，示肌束間中小動脈管壁未見增厚，管壁無縮小，管腔內(nèi)充滿新鮮的紅細胞.

基因的空質(zhì)粒處理的對照組犬的相應(yīng)肢體中，更早而更多地出現(xiàn)新生的血管，轉(zhuǎn)染pUDKH后90d血管造影可見到血管“橋”和“網(wǎng)”的大量的形成，髂外動脈完全結(jié)扎點血流仍然通暢，在結(jié)扎點周圍有許多血管“網(wǎng)”和血管“橋”，使髂外動脈與股動脈血流通暢無阻，結(jié)扎點下方的股動脈血管變粗，血管充盈，使缺血損傷的股動脈的血管功能恢復(fù)，骨骼肌內(nèi)、外側(cè)有大量小血管形成，有助于股動脈遠端的肌肉組織血液供應(yīng)，從而使轉(zhuǎn)染pUDKH動物肢體功能恢復(fù)，提高了動物的生存質(zhì)量. 本文通過結(jié)扎后3 mo活殺時所取標本進行常規(guī)組織病理學觀察的結(jié)果，也為此提供了組織形態(tài)學的證據(jù). 轉(zhuǎn)染pUDKH 0.15，0.30，0.60 mg/kg三個劑量組之間差別不明顯，0.60 mg/kg組比其他2個給藥組更容易使髂外動脈結(jié)扎點到股動脈接點縮短或完全融合成一個完整的血管網(wǎng). 轉(zhuǎn)染pUDKH的三個劑量組在/100 cm2骨骼肌內(nèi)、外側(cè)和皮膚中血管數(shù)明顯比模型對照組多，差別非常明顯. 與未手術(shù)的右下肢骨骼肌內(nèi)、外側(cè)和皮膚比較，無明顯的差異. 轉(zhuǎn)pUDKH基因大、中、小劑量組犬骨骼肌組織之間的血管數(shù)與健康肢骨骼肌組織血管數(shù)相差不明顯，表明轉(zhuǎn)染pUDKH的骨骼肌組織內(nèi)血管并沒有因藥物劑量增加而血管成倍量的增長.

由于被結(jié)扎的肢體于用HGF處理后得到了充分的血液供應(yīng)，該患肢的肌肉也理所當然地獲得了足夠的氧氣和必需的營養(yǎng)物質(zhì)，從而促使其恢復(fù)因缺氧和營養(yǎng)物質(zhì)而造成的結(jié)構(gòu)與功能的損傷. 本文的組織病理學觀察結(jié)果也為此提供了形態(tài)學的證據(jù). 此外，結(jié)扎股動脈后只予以空白質(zhì)粒處理犬的患肢肌肉中出現(xiàn)有肌纖維變細、斷裂或某些肌束中有缺失肌組織以及脂肪組織浸潤的現(xiàn)象，而在pUDKH處理組肌束中則少見這種圖像；因此可以推測，隨著血運逐漸重建的過程，已發(fā)生變性的肌肉就會發(fā)生逆轉(zhuǎn)，而肌組織缺失處也會有新生的肌纖維予以補充. 這也是可能發(fā)生的，因已有報道表明HGF對能夠形成新生肌纖維的肌衛(wèi)星細胞有刺激增殖的作用［5］.

本文觀察的結(jié)果（資料未列出）還表明，因股動脈被結(jié)扎而使血運嚴重受到干擾的患肢中從股神經(jīng)直到肌束間的細小神經(jīng)都發(fā)生了顯著的退行變，累及軸突、髓鞘和施旺氏細胞核，而經(jīng)pUDKH處理犬的各級神經(jīng)均已得到了明顯的恢復(fù)，有的甚至已經(jīng)達到了正常犬的圖像. 這些外周神經(jīng)的恢復(fù)，估計得利于HGF的雙重作用：①缺血造成的神經(jīng)纖維損傷，由于HGF促進了供血系統(tǒng)的重建而得以修復(fù)；②據(jù)文獻報道HGF本身也有促進神經(jīng)恢復(fù)的作用［6］. 這兩種因素在本實驗?zāi)Ｐ椭芯肯蹈髌鸬蕉啻蟊戎?，目前尚無法加以估計.

本實驗只是一個探索性的工作，因而沒有在結(jié)扎并用空白的或攜帶HGF基因的裸露質(zhì)粒處理后的不同時間段，進行系統(tǒng)性的動態(tài)取樣觀察. 推測在血管新生和形成血管網(wǎng)的早期節(jié)段，能夠在劑量效應(yīng)關(guān)系方面，或全或半結(jié)扎模型的療效差別方面作出一定的評價. 如有可能今后可以做這方面的探討，還要做一些特殊染色（例如肌肉和髓鞘等特殊染色方法）的觀察. 除此之外，如有條件，還可做一些生理學指標的觀察，例如在供血系統(tǒng)重建過程中對肌力和神經(jīng)傳導(dǎo)速度的動態(tài)觀測量等.

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篇10

【關(guān)鍵詞】消化系統(tǒng)；基因診斷；治療

【中圖分類號】R57 【文獻標識碼】C 【文章編號】1008-6455（2010）11-0186-01

1基因診斷技術(shù)及應(yīng)用

基因診斷是以基因型為基本，因而可在疾病未出現(xiàn)癥狀前，及至胚胎時期便可明確診斷。傳統(tǒng)基因診斷時常應(yīng)用基因探針技術(shù)和聚合酶金鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)檢測相關(guān)基因的核苷酸序列?；蛱结樇夹g(shù)包括斑點雜交、Southern印跡法、Northern印跡法、原位雜交竺，其中以Southern印跡法最為常用，但這些技術(shù)操作復(fù)雜、自動化程序低，對洗繁的基因篩選幾乎是無能為力的?；蛐酒夹g(shù)的旌為疾病的基因診斷提供了新的解決方案?；蛐酒╣ene chip），也稱基因微矩陣（microarray），是在玻璃、硅待載體上有序地、高密度地（目前點與點之間的距離小于500um）排列，以固定大量的靶基因片段（也稱分子探針）。樣品核酸分子經(jīng)過標記，與固定在載體上的DNA陣列中的點同時進行雜交，雜交信息通過計算機進行集約化和平行處理，獲得信息量的效率是傳統(tǒng)生物學技術(shù)無法比擬的，可以同時研究成千上萬個基因地某種生理和病理條件下的表達變化，為疾病的基因診斷提供了一個強有力的工具。

消化系統(tǒng)惡性腫瘤是一類多基因異常疾病，在腫瘤發(fā)病的不同階段，可 相應(yīng)的基因異常，一直為基因診斷研究的熱點。與已明確胰腺癌最常見的基因異常是K-ras基因12密碼子的點突變，食管癌、胃癌、結(jié)腸癌、肝癌的P53突變率達50%-60%，胃癌中CD44異常表達幾近100%，結(jié)腸癌中K-ras點突變也達80%?；蛐酒瑸榘┫嚓P(guān)基因大規(guī)模篩查提供了可能，目前國內(nèi)外已有學者應(yīng)用基因芯片技術(shù)對食管癌、肝癌、結(jié)直腸癌和胰腺癌等組織或體外細胞株進行基因表達譜的研究，成功地發(fā)現(xiàn)了涉及細胞生長周期、細胞內(nèi)信號傳遞、炎癥反應(yīng)和細胞因子等上百條表達上調(diào)或下調(diào)的基因，并結(jié)合基因?qū)氲姆椒ǎ_展了關(guān)鍵基因的功能研究，如：Lu等應(yīng)用cDNA芯片篩查了正常黏膜組織、輕度不典型增生、中度不典型增生、原位癌（CIS）和鱗狀細胞癌等5個級別食管病變組織細胞基因表達譜的改變，通過聚類分析發(fā)現(xiàn)了一批與食管癌的基因草圖，構(gòu)建人結(jié)直腸癌、正常結(jié)腸黏膜和結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移灶的基因表達情況。可以設(shè)想：應(yīng)用基因技術(shù)分析腫瘤不同階段基因表達譜的改變，找出與惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展、生物學特征、治療敏感性及不同預(yù)后有關(guān)的基因，重新組合、設(shè)計制作成用于惡性腫瘤早期診斷、疾病特征分析和預(yù)后判斷的工具芯片，理論上是完全可行的。雖然基因消化系統(tǒng)腫瘤的基因診斷中剛剛起步，但已顯示出廣闊的應(yīng)用前景。

除對腫瘤的診斷外，基因診斷還應(yīng)用到消化系多個方面。炎癥性腸 （Znflammatory Bowel Disease，ZBD）因在我國的發(fā)病呈顯著上升趨勢而得到越來越多的關(guān)注，IBD病因至今不清，種族發(fā)病差異較大，近年來在歐美和澳大利亞進行了疾病候選基因的研究和篩查，已成功定位了疾病相關(guān)連鎖區(qū)，主要有16、12、6、14和5號染色體，已分別命為IBD1-5，并發(fā)現(xiàn)了NOD2基因，NOD2基因產(chǎn)物為細菌組分的細胞內(nèi)受體，由此證明了IBD與天然免疫之間的重要聯(lián)系。

2基因治療方法與應(yīng)用

基因治療是指將新的遺傳物質(zhì)（治病基因）轉(zhuǎn)入由于基因缺陷而致病的細胞或組織中，以糾正疾病細胞的表型，達到治療疾病目的的一類治療方法。用于基因治療的基因轉(zhuǎn)移方法分兩大類：一類為病毒載體，包括應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄前病毒載體、腺病毒載體、腺相關(guān)病毒載體、單純皰疹病毒載體、痘苗病毒等。近年來，又探索將慢病毒家庭中的人免疫缺陷病毒（HIV）經(jīng)改造作為載體。第二類基因轉(zhuǎn)移方法為非病毒法，包括陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法、裸DNA直接注射法、磷酸鈣沉淀法、微粒子轟擊法（基因槍）、微注射法、受體介導(dǎo)法等。

目前，一個新基因治療系統(tǒng)-EC-CD/5-FC（大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶、5-氟胞嘧啶）系統(tǒng)正日益受到高度關(guān)注。胞嘧啶脫氨酶是大腸桿菌代謝旁路中的一種酶，哺乳動物細胞中不含該酶。Ausin等于1992年首先從大腸桿菌菌株中采用傳統(tǒng)方法提取質(zhì)粒DNA，并初步構(gòu)建成原核細胞中表達的CD質(zhì)粒載體，由于哺乳動物細胞中不存在胞嘧啶脫氨酶，因而不能將胞嘧啶轉(zhuǎn)化成尿嘧啶，更不能將5-氟胞嘧啶（5-Fluorocytosine，5-FC）轉(zhuǎn)化成5-氟尿嘧啶（5-Flu-orouracil，5-FU）。但通過基因轉(zhuǎn)移技術(shù)將胞嘧啶脫氨酶基因轉(zhuǎn)入哺乳動物細胞，則哺乳動物細胞可將一些原來無毒性的原藥（5-FC）經(jīng)胞嘧啶脫氨酶轉(zhuǎn)化為有細胞毒性的代謝產(chǎn)物（5-FU），導(dǎo)致細胞自殺性死亡。現(xiàn)已用于結(jié)腸癌、肝癌、胰腺癌等多種消化系腫瘤的研究，取得了很好的效果，但設(shè)計安全、高效、穩(wěn)定、特異、可控、簡便易行并可攜帶不同長度DNA的新載體仍是該基因治療研究中亟待解決的問題。