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【摘要】目的探討姜黃素對(duì)大腸埃希菌引起的細(xì)菌膿毒癥小鼠的保護(hù)作用。方法昆明種小鼠90只隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組和姜黃素組,每組30只。姜黃素組腹腔注射姜黃素固體分散劑,每天1次,連續(xù)3d。第4天,模型組和姜黃素組尾靜脈注射041184大腸埃希菌標(biāo)準(zhǔn)菌懸液建立細(xì)菌膿毒癥模型。8h后,每組處死小鼠20只檢測(cè)血清天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、腫瘤壞死因子α(TNFα)和一氧化氮(NO)含量,觀察肝、腎、肺和腸等臟器病理改變,余下小鼠觀察24h生存率。結(jié)果姜黃素組血清AST、ALT、TNFα和NO含量明顯低于模型組(P<0.05),病理檢查見(jiàn)臟器損害亦明顯減輕;24h存活率90%,明顯高于模型組(50%)。結(jié)論姜黃素可減少細(xì)菌膿毒癥小鼠TNFα、NO和氧自由基的產(chǎn)生,減輕其臟器病理?yè)p害。

【關(guān)鍵詞】姜黃素休克膿毒大腸桿菌疾病模型動(dòng)物

ABSTRACT:ObjectiveToinvestigatetheeffectsofcurcumin(Cur)onbacterialsepsisinducedbyEscherichiacoli(E.coli)inmice.MethodsSixtymiceweredividedinto3groupsatrandom:acontrolgroup,aninfectedgroupandacurcumingroup.Curgroup:intraabdominalinjectionofcurcuminsoliddispersant(200mg/kg)wasgivenforthreedays.Theinfectedgroup:078E.coli(51010cfu/L,10mL/kg)wasadministratedbyintravenousinjectiontocreatethebacterialsepsismicemodel.8hoursaftertheinjection,thelevelofAST,ALT,andTNFαandNOofeachgroupwasmeasuredandmiceweresacrifiedtoobservethepathologicalchangeofliver,ridney,lungandintestines.ResultsCurcumincanremarkablyreducetheleveloftheASTandALTintheserumofthebacterialsepsismiceinducedbyE.coli(P<0.05)aswellasthatofTNFα(P<0.05)andNO(P<0.05).Meanwhile,itcansignificantlydecreasethepathologicalchangeofliver.ConclusionCurcumincanplayanimportantroletoprotectthemicefrombacterialsepsisbywaysofcytotoxiceffectsofNO,TNFαandoxygenfreeradicals.

KEYWORDS:curcumin;shock,septic;Escherichiacoli;diseasemodels,animal

福建醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)2008年7月第42卷第4期侯君藝等：姜黃素防治細(xì)菌膿毒癥小鼠的實(shí)驗(yàn)研究膿毒癥是由嚴(yán)重細(xì)菌感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征的晚期失代償表現(xiàn),是嚴(yán)重?zé)齻?chuàng)傷和感染的常見(jiàn)并發(fā)癥，進(jìn)一步發(fā)展可導(dǎo)致膿毒癥性休克、多器官功能障礙綜合癥(multipleorgandysfuctionsyndrome,MODS)。1980年以來(lái),對(duì)于細(xì)菌膿毒癥和MODS發(fā)生的分子機(jī)制的研究,特別是對(duì)脂多糖(LPS)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的深入研究,引發(fā)一系列阻斷內(nèi)毒素信號(hào)通路和對(duì)抗各種單一介質(zhì)的治療制劑的產(chǎn)生。但迄今尚沒(méi)有一種制劑能夠顯著降低膿毒癥性體克的臨床死亡率[1]。姜黃素為姜黃的主要活性成分,具抗氧化、抗炎等藥理作用,能減少各種炎癥介質(zhì)的合成和分泌[2]。筆者采用大腸埃希菌制備小鼠細(xì)菌膿毒癥模型,探討姜黃素預(yù)防給藥對(duì)細(xì)菌膿毒癥的保護(hù)作用。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1動(dòng)物

清潔級(jí)雄性ICR小鼠90只,體質(zhì)量(25±2)g,福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(閩)200400023]。90只小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組和姜黃素組,每組30只。

1.1.2試劑與儀器

姜黃素(上海試劑三廠,批號(hào):051105),自制為固體分散體制劑。041184大腸埃希菌標(biāo)準(zhǔn)株(福建醫(yī)科大學(xué)病原微生物研究所)。門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)試劑盒(中生北控生物技術(shù)股份有限公司)。NO試劑盒(南京建成生物研究所,批號(hào)20070510)。小鼠TNFαELISA試劑盒(深圳晶美生物公司,批號(hào)20070610)。全自動(dòng)生化分析儀(意大利EosGravo公司);酶標(biāo)儀(550型,美國(guó)BioRad公司);自動(dòng)組織脫水機(jī)(TP1020,德國(guó)萊卡公司);生物組織自動(dòng)包埋機(jī)(TB718E,湖北泰維醫(yī)療科技有限責(zé)任公司);石蠟切片機(jī)(RM2235,德國(guó)萊卡公司)。

1.2方法

1.2.1給藥

姜黃素組腹腔注射姜黃素200mg/kg,每天1次,連續(xù)3d；對(duì)照組和模型組給予等量生理鹽水。第4天,模型組和姜黃素組無(wú)菌操作尾靜脈注射大腸埃希菌041184標(biāo)準(zhǔn)菌株懸液5×1010cfu/L,10mL/kg,制備細(xì)菌膿毒癥模型[3]。

1.2.2檢測(cè)指標(biāo)

1.2.2.1血清NO及TNFα測(cè)定

尾靜脈注射后8h,每組處死20只,收集血清檢測(cè)NO及TNFα含量,NO用硝酸酶還原法測(cè)定,TNFα用雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)。

1.2.2.2血清ALT、AST測(cè)定

采用多功能生化分析儀(意大利EosGravo公司)測(cè)定。

1.2.2.3病理組織學(xué)檢查

切取肝、腎、肺、腸等臟器組織,10%甲醛固定,HE染色,觀察病理?yè)p害程度。

1.2.2.4生存率測(cè)定

密切觀察注射細(xì)菌后3d內(nèi)小鼠的一般情況,記錄死亡時(shí)間。根據(jù)公式計(jì)算生存率：

生存率(%)=（72h存活的小鼠數(shù)/各組小鼠數(shù)）×100

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)用x±s表示,組間及組內(nèi)均數(shù)差異的顯著性比較采用t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1血清TNFα、NO及ALT、AST

模型組和姜黃素組血清TNFα、NO及ALT、AST含量明顯高于對(duì)照組(P<0.05),與模型組比較,姜黃素組血清TNFα、NO及ALT、AST含量明顯降低(P<0.05,表1)。表1姜黃素對(duì)血清TNFα、NO及ALT、AST的影響（略）

2.2主要臟器病理學(xué)

對(duì)照組的肝臟結(jié)構(gòu)正常，未見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，模型組肝臟損害明顯,肝組織大量壞死,伴有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1B),其他臟器病理改變較輕;姜黃素組肝組織結(jié)構(gòu)尚清楚,變性壞死程度明顯減輕,亦可見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1C),其他臟器未見(jiàn)明顯病理?yè)p害。

3討論

3.1細(xì)菌性膿毒血癥模型的建立

細(xì)菌性膿毒血癥模型復(fù)制方法可分為細(xì)菌攻擊模型和局部感染模型兩大類(lèi)[4]。通過(guò)注射細(xì)菌建立模型的方法不但可以使動(dòng)物感染,又可以誘發(fā)動(dòng)物內(nèi)毒素中毒,能更好的模擬疾病的臨床病理生理變化。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)尾靜脈注射大腸埃希菌后,小鼠血清炎癥因子TNFα和NO持續(xù)升高,肝功能指標(biāo)ALT、AST急劇升高,病理檢查可見(jiàn)多臟器損害,說(shuō)明已成功制備細(xì)菌性膿毒血癥模型。

3.2姜黃素藥理作用

與細(xì)菌性膿毒血癥發(fā)病有關(guān)的體液性炎性介質(zhì)眾多,各種炎性介質(zhì)相互影響,構(gòu)成了復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)。TNFα是細(xì)菌性膿毒血癥時(shí)一個(gè)早期的促炎因子,可以激活NFκB,可促使其他炎癥介質(zhì)大量過(guò)度釋放,如誘導(dǎo)合成型一氧化氮合酶(iNOS)大量表達(dá),合成反應(yīng)極強(qiáng)的自由基NO,直接或間接介導(dǎo)內(nèi)毒素對(duì)組織器官的損傷[5]。在姜黃素的相關(guān)藥理研究中,已有報(bào)道顯示姜黃素可以通過(guò)抑制LPS誘導(dǎo)產(chǎn)生抑制κB激酶l、抑制κB激酶2活性,從而抑制NFκB的核內(nèi)轉(zhuǎn)移,減少TNFa的生成[6]。Marion等也發(fā)現(xiàn)姜黃素體能夠抑制由LPS誘導(dǎo)的小鼠肝臟和腹腔巨噬細(xì)胞iNOS的基因表達(dá),抑制巨噬細(xì)胞釋放NO[7]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,姜黃素預(yù)防給藥可顯著降低細(xì)菌性膿毒血癥小鼠血清TNFα和NO含量,這可能是姜黃素抗細(xì)菌性膿毒血癥的重要機(jī)制。此外,大量研究證明,姜黃素具抗氧化、抗炎、清除自由基,并對(duì)肝臟具有保護(hù)作用[8]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,姜黃素預(yù)防給藥可明顯降低細(xì)菌性膿毒血癥小鼠血清的ALT、AST的含量,減輕肝臟病理?yè)p害,明顯的提高細(xì)菌性膿毒血癥小鼠72h生存率。

【參考文獻(xiàn)】

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