導(dǎo)語(yǔ)：大鼠肝卵圓細(xì)胞細(xì)胞間黏附分子論文一文來(lái)源于網(wǎng)友上傳，不代表本站觀點(diǎn)，若需要原創(chuàng)文章可咨詢客服老師，歡迎參考。

【摘要目的摘要:探索細(xì)胞間黏附分子1(ICAM1)在肝卵圓細(xì)胞(HOCs)中的表達(dá),及核因子(NFκB)對(duì)其表達(dá)的調(diào)控功能.方法摘要:0.6g/kg3′甲基4二甲基胺偶氮苯（3′methyldimethylaminoazobenzene,DAB）飼喂Wistar大鼠4wk,制作肝損傷模型.利用Percoll密度梯度離心法分離HOCs,免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)HOCs對(duì)ICAM1的表達(dá)；體外培養(yǎng)HOCs并分別用NFκB激動(dòng)劑TNFα和NFκB抑制劑TGFβ1干預(yù),RTPCR對(duì)ICAM1mRNA進(jìn)行半定量分析,比較在TNFα和TGFβ1的調(diào)控下ICAM1mRNA表達(dá)的變化.結(jié)果摘要:HOCsICAM1免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)明顯陽(yáng)性.和對(duì)照組比較,體外培養(yǎng)HOCs時(shí)TNFα促進(jìn)HOCs的增殖(P%26lt;0.01),TGFβ1對(duì)HOCs的增殖能力無(wú)明顯影響；RTPCR半定量分析,和對(duì)照組比較，TNFα組ICAM1mRNA相對(duì)灰度值增高(P%26lt;0.01),而TGFβ1組ICAM1mRNA相對(duì)灰度值降低(P%26lt;0.01).結(jié)論摘要:在肝損傷組織中HOCs表達(dá)ICAM1,TNFα和TGFβ1分別通過(guò)對(duì)NFκB活性的促進(jìn)和抑制來(lái)調(diào)控ICAM1的表達(dá).

【細(xì)胞間黏附分子1;肝卵圓細(xì)胞；核因子κB

0引言

近年來(lái),肝卵圓細(xì)胞（hepaticstemcells,HOCs）的探究受到重視［1］.在大鼠肝損傷和肝癌模型的肝組織中存在HOCs大量增生［2］,但哪種細(xì)胞表達(dá)ICAM1還不完全清楚.骨髓造血干細(xì)胞（hemopoieticstemcells,HSCs）表面存在一組以ICAM1為主的黏附分子,能介導(dǎo)HSCs和骨髓基質(zhì)的黏附,從而使HSCs產(chǎn)生一種定向遷移的功能［3］.探究表明,HOCs可以來(lái)自于HSCs.既然HOCs可以來(lái)自于HSCs,且HSCs表達(dá)ICAM1,那么HOCs也應(yīng)象HSCs一樣能表達(dá)ICAM1.為此,我們探究HOCs表達(dá)ICAM1的證據(jù)及其調(diào)控.

1材料和方法

1.1材料

Wistar大鼠6只,雌雄不限,體質(zhì)量(110±10)g,由南方醫(yī)科大學(xué)(原第一軍醫(yī)大學(xué))實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供.3′甲基4二甲胺基偶氮苯（3′methyldimethylaminoazobenzene,DAB）購(gòu)于日本東京化成株式會(huì)社；Percoll分離液購(gòu)自Pharmacia公司；兔抗鼠ICAM1，即用型SABC試劑盒及DAB顯色劑購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；引物由上海生工生物工程公司設(shè)計(jì)合成,βantinsenseprimer5′GCATTGTAACCAACTGGGACG3′,antisenseprimer5′TTGCCGATAGTGATGACCT3′,擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為535bp；ICAM1senseprimer,5′CGTGCTGTATGGTCCTCG3′,antisenseprimer5′GGGCTTGTCCCTTGAGTT3′,擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度422bp；Marker購(gòu)于上海生工生物工程公司；總RNA提取試劑盒、mRNA逆轉(zhuǎn)錄酶、Taq聚合酶購(gòu)于Promega公司；Ⅳ型膠原酶、TNFα,TGFβ1購(gòu)于Sigma公司.

1.2方法

Wistar大鼠正常飼喂1wk后,給予含0.6g/kgDAB飼料飼養(yǎng),正常飲水,于4wk后大鼠1只,戊巴比妥鈉麻醉(25mg/kg,ip),開(kāi)腹,門(mén)靜脈切開(kāi)插管,25mL/min灌注DHanks液至肝表面淡黃除去肝組織里的血液,灌注0.6g/LⅣ型膠原酶至肝組織黃色糜狀,將整塊肝組織移入燒杯搗碎,于震蕩箱37℃恒溫震蕩消化40min,經(jīng)100目篩網(wǎng)過(guò)濾,未過(guò)濾的組織塊繼續(xù)搗碎,加入0.6g/LⅣ型膠原酶繼續(xù)震蕩消化40min,收集過(guò)濾液分裝于離心管中4℃100g離心10min,取上清液分裝于離心管4℃1000g離心30min,棄上清液,用DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞懸液.高速離心管分裝Percoll梯度離心液,細(xì)胞液鋪于上層,4℃12000g離心30min,吸取700mL/L和500mL/L之間細(xì)胞液,DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液稀釋,4℃1000g離心30min,棄上清液,用150mL/L胎牛血清稀釋細(xì)胞密度至1.0×109/L.取4個(gè)12孔培養(yǎng)板分別標(biāo)記為A，B，C，D4組,每組又分為Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ亞組,每亞組4孔,各孔加入上述細(xì)胞懸液0.5mL,然后加適量細(xì)胞培養(yǎng)基,Ⅰ亞組為空白對(duì)照組,Ⅱ亞組和Ⅲ亞組分別加入2.0×105U/L的TNFα和10mg/L的TGFβ1.分別于3，6，9，12d計(jì)數(shù)A，B，C，D組中各1組的細(xì)胞數(shù).

1.2.1ICAM1免疫細(xì)胞化學(xué)上述細(xì)胞液適量滴于防脫片處理的清潔載玻片上,培養(yǎng)8h后細(xì)胞黏附貼壁.具體操作按SABC法試劑盒說(shuō)明進(jìn)行.光鏡下觀察結(jié)果.

1.2.2ICAM1的RTPCR取上述培養(yǎng)6d的3組培養(yǎng)細(xì)胞分別加入不同離心管,參照試劑盒說(shuō)明書(shū)按常規(guī)方法提取總RNA，將RNA沉淀于室溫晾干,溶于適量無(wú)RNA酶水中.在3支0.2mLEppendorf管中依次加入上述總RNA1μL,10×逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液2μL,AMV逆轉(zhuǎn)錄酶2μL,10mmol/L4×dNTPs2μL,RNA酶抑制劑1μL,ICAM1和βactinantisenseprimer等量1μL,然后加入無(wú)RNA酶水至20μL,充分混勻,42℃反應(yīng)60min,99℃5min.PCR擴(kuò)增反應(yīng)摘要:在0.2mLEppendorf管依次加入10×PCR緩沖液2μL,上述逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1μL,ICAM1和βactinsenseprimer1μL,TaqDNA聚合酶0.5μL,加三蒸水補(bǔ)至20μL,混勻后10000g離心30s,加液體石蠟20μL.在72℃下擴(kuò)增35個(gè)循環(huán),末次循環(huán)后延伸6min.取各擴(kuò)增產(chǎn)物、marker各4μL,于瓊脂糖凝膠電泳.紫外檢測(cè)儀下觀察并拍照結(jié)果,電泳圖用GelProanalyzer3.1進(jìn)行分析.重復(fù)檢測(cè).

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理摘要：數(shù)據(jù)以x±s表示，并采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行析因設(shè)計(jì)資料的方差分析和單因素方差分析.

2結(jié)果

2.1HOCs體外培養(yǎng)Porcoll密度梯度離心法分離出HOCs,呈圓形或卵圓形,大小約為正常肝細(xì)胞的1/3(Fig1).ICAM1呈明顯陽(yáng)性表達(dá)(Fig2).用TNFα和TGFβ1干預(yù)3，6，9和12d計(jì)數(shù)觀察HOCs增殖情況,用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件行析因設(shè)計(jì)資料的方差分析(Tab1),和對(duì)照組比較,TNFα干預(yù)組HOCs增殖更顯著(P%26lt;0.01),而TGFβ1干預(yù)組無(wú)顯著差異(P%26gt;0.05).3組的增殖在12d內(nèi)均隨時(shí)間的增多而增加(P%26lt;0.01).表1TNFα和TGFβ1對(duì)HOCs增殖能力的影響（略）

2.2HOCs的ICAM1RTPCR半定量檢測(cè)和對(duì)照組比較，TNFα組ICAM1mRNA相對(duì)灰度值增高(P%26lt;0.01,Tab2，F(xiàn)ig3),而TGFβ1組ICAM1mRNA相對(duì)灰度值降低(P%26lt;0.01).TNFα組ICAM1表達(dá)較對(duì)照組增強(qiáng),而TGFβ1組較對(duì)照組減弱.表2ICAM1mRNA灰度值（略）

3討論

ICAM1是黏附分子免疫球蛋白超家族的一種重要糖蛋白.在生理狀態(tài)下,肝臟中的內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、白細(xì)胞等多種細(xì)胞均可表達(dá)ICAM1,但表達(dá)數(shù)量不多.肝臟損傷時(shí),肝組織中ICAM1表達(dá)明顯增多,并且,肝損傷時(shí)HOCs大量增生［2］.本結(jié)果表明,HOCs表達(dá)ICAM1.據(jù)此,我們認(rèn)為,肝損傷時(shí)肝組織中ICAM1表達(dá)增多的原因,除炎癥因子刺激使上皮細(xì)胞、白細(xì)胞等表達(dá)ICAM1增多外,主要是因?yàn)镠OCs增生,從而使肝組織中ICAM1的表達(dá)增多.肝損傷組織中ICAM1表達(dá)增強(qiáng),有二種原因摘要:一是能表達(dá)ICAM1的細(xì)胞增多；二是受某些因素的調(diào)控,細(xì)胞對(duì)ICAM1的表達(dá)增強(qiáng).Melotti等［4］發(fā)現(xiàn)ICAM1的表達(dá)受核因子κB(NFκB)的調(diào)控,阻斷NFκB的活性則可抑制細(xì)胞對(duì)ICAM1的表達(dá).Hill等［5］發(fā)現(xiàn),TNFα能激活成纖維細(xì)胞的NFκB,并使ICAM1的表達(dá)增加.我們發(fā)現(xiàn),TNFα干預(yù)下的HOCs對(duì)ICAM1的表達(dá)能力增強(qiáng),而TGFβ1則抑制HOCs對(duì)ICAM1的表達(dá).據(jù)此我們認(rèn)為,TNFα和TGFβ1對(duì)HOCs表達(dá)ICAM1的調(diào)控可能也是通過(guò)調(diào)節(jié)NFκB的活性來(lái)實(shí)現(xiàn)的,但TGFβ1的抑制功能明顯弱于TNFα的促進(jìn)功能.總之,肝損傷時(shí)肝組織中HOCs增生,并表達(dá)ICAM1,其表達(dá)強(qiáng)度受NFκB的調(diào)控.

【參考文獻(xiàn)

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