導(dǎo)語：乳腺癌端粒酶活性管理論文一文來源于網(wǎng)友上傳，不代表本站觀點(diǎn)，若需要原創(chuàng)文章可咨詢客服老師，歡迎參考。

摘要：目的探討端粒酶活性與增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)表達(dá)之間的關(guān)系及聯(lián)合檢測對(duì)乳腺癌術(shù)后治療方案制定和預(yù)測預(yù)后的意義。方法采用端粒重復(fù)序列擴(kuò)增聚合酶鏈反應(yīng)-酶聯(lián)免疫吸附測定法(TRAP-PCR-ELISA)和免疫組織化學(xué)鏈霉素生物蛋白過氧化物酶(S-P)法對(duì)80例乳腺癌組織、36例乳腺癌相應(yīng)癌旁組織和10例乳腺良性病變的端粒酶活性及增殖細(xì)胞核抗原進(jìn)行檢測。結(jié)果(1)80例乳腺癌患者癌組織標(biāo)本、36例乳腺癌相應(yīng)癌旁組織標(biāo)本中端粒酶表達(dá)陽性率分別為650%和83%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P001)；10例乳腺良性病變組織標(biāo)本中未檢測出端粒酶活性；腋窩淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移與端粒酶陽性表達(dá)率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P005)。(2)80例乳腺癌組織中PCNA的陽性表達(dá)率為6375%；乳腺癌有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組PCNA陽性表達(dá)率顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(P001)，且呈正相關(guān)(P001)，即淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度越低，PCNA陽性表達(dá)率亦越低。(3)端粒酶活性與PCNA表達(dá)具有一致性(P001)，且呈正相關(guān)(P001)，一致率為8625%。結(jié)論端粒酶活性與PCNA表達(dá)具有一致性，端粒酶活性與PCNA聯(lián)合檢測，可為乳腺癌術(shù)后治療方案的制定和預(yù)測預(yù)后提供輔助依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】乳腺癌；端粒酶；增殖細(xì)胞核抗原；多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；免疫組織化學(xué)

增殖細(xì)胞核抗原(proliferatingcellnuclearantigen,PCNA)是一種表達(dá)細(xì)胞增殖周期的36kd多肽，直接參與細(xì)胞增殖過程中DNA的復(fù)制，其表達(dá)程度能客觀反映腫瘤細(xì)胞的增殖活性，過度表達(dá)增加了瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移趨勢的危險(xiǎn)性，PCNA可作為判斷腫瘤預(yù)后的指標(biāo)〔1〕。為探索乳腺癌組織端粒酶活性與增殖細(xì)胞核抗原表達(dá)的關(guān)系，對(duì)80例乳腺癌組織、36例乳腺癌相應(yīng)癌旁組織和10例乳腺良性病變的端粒酶活性及增殖細(xì)胞核抗原進(jìn)行檢測。

1對(duì)象與方法

11對(duì)象收集我院1992～2002年女性乳腺癌根治標(biāo)本病理檢查存檔資料80例，乳腺癌相應(yīng)癌旁組織(距離腫瘤2cm以上)36例，年齡32～72歲，平均年齡4846歲；乳腺良性病變10例，平均年齡3850歲。全部資料經(jīng)2位病理醫(yī)師審核，患者術(shù)前未做過放、化療。乳腺癌分類根據(jù)“中國常見惡性腫瘤診治規(guī)范”分為非浸潤性癌、早期浸潤性癌、浸潤性特殊癌、浸潤性非特殊癌4類。

12試劑與儀器端粒多聚酶鏈反應(yīng)-酶聯(lián)免疫吸附(TelomerasePCRELISA)試劑盒(德國BoehringerMannhein公司)；陽性對(duì)照為腫瘤293細(xì)胞株(檢測試劑盒提供)；陰性對(duì)照為不含蛋白的裂解液；Ⅰ抗PCNApc10和鏈霉素生物蛋白過氧化物酶(S-P)試劑盒及過氧化物酶底物作用液二氨基聯(lián)苯氨(Diaminobenzidine,DAB)(北京中山生物技術(shù)有限公司)；用已知乳腺癌組織陽性切片(北京中山生物技術(shù)有限公司)為陽性對(duì)照，用磷酸鹽緩沖液(phosphatebufferedsaline,PBS)代替Ⅰ抗做陰性對(duì)照。酶標(biāo)儀(SPECTRAⅢ)(美國Dynex公司)PCR(T-1thermoblock)(德國Biometra公司)。

13端粒酶活性檢測(1)端粒酶提?。好糠輼?biāo)本用病理切片機(jī)切10～15μm厚50片，加入預(yù)冷的端粒酶裂解液20μl，放置冰上裂解30min，1600r/min4℃離心20min，取175μl上清液為提取液，放置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?2)端粒酶活性檢測：端粒重復(fù)序列擴(kuò)增-多聚酶鏈反應(yīng)-酶聯(lián)免疫吸附(TRAP-PCR-ELISA)法〔2，3〕，取細(xì)胞提取液1～2μl加入25μl端粒重復(fù)序列擴(kuò)增-多聚酶鏈反應(yīng)(TRAPPCR)擴(kuò)增液；無菌二乙基焦碳酸酯(diethyprocarbonate,DEPC)水補(bǔ)足至體積50μl混勻；在PCR擴(kuò)增儀上按以下步驟進(jìn)行引物的延伸及擴(kuò)增反應(yīng)：95℃5min預(yù)變性，再以94℃30s變性、50℃30s退火、72℃90s延伸，共循環(huán)30個(gè)周期，最后72℃延伸10min。取上述PCR產(chǎn)物5μl加變性試劑20μl混勻，置室溫10min；加入雜交液225μl混勻后取出100μl移至包被于抗地高辛的酶標(biāo)板中室溫作用2h；加入抗地高辛過氧化物酶并與底物作用30min后終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀測其在波長450nm的吸光度(A)值。

14PCNA檢測采用免疫組織化學(xué)S-P法染色，按試劑盒說明書操作：所有標(biāo)本均經(jīng)10%福爾馬林固定，石蠟包埋，4μm連續(xù)切片。二甲苯脫蠟，梯度酒精至水化后高壓鍋熱處理5～8min，過氧化物酶阻斷血清封閉，加Ⅰ抗60min，PBS液洗3次，每次2min；Ⅱ抗15min，PBS液洗3次。每次2min；Ⅲ抗同Ⅱ抗。DAB顯色5～10min，蘇木素復(fù)染5～10s，脫水，透明膠封片。

15結(jié)果判斷端粒酶以吸收度(A)020為陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)。PCNA以細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)清晰的棕色或棕黃色顆粒為陽性診斷標(biāo)準(zhǔn)，每例切片至少觀察5個(gè)高倍視野。

16統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS100軟件對(duì)各組端粒酶及PCNA陽性表達(dá)率進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，F(xiàn)isher確切概率檢驗(yàn)和Kendall等級(jí)相關(guān)分析。

2結(jié)果

21各部位端粒酶活性表達(dá)及與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系80例乳腺癌患者癌組織標(biāo)本端粒酶表達(dá)陽性率為650%(52/80)；36例乳腺癌相應(yīng)癌旁組織標(biāo)本端粒酶表達(dá)陽性率為83%(3/36)；10例乳腺良性病變組織標(biāo)本中未檢測出端粒酶活性。各部位端粒酶陽性表達(dá)率總體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P001)，但進(jìn)一步分析，癌組織與癌旁相應(yīng)組織、癌組織與良性病變組織端粒酶陽性表達(dá)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=31975，P≤0001；χ2=15395，P≤0001)，而癌旁相應(yīng)組織與良性病變組織端粒酶陽性表達(dá)率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P005)；端粒酶陽性表達(dá)率與部位呈正相關(guān)(rs=055,P0001)。端粒酶陽性表達(dá)率與腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2473，P005)。

表1PCNA陽性表達(dá)率與乳腺癌組織類型及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系（略）

注：*P005,**P001；rsKendall等級(jí)相關(guān)系數(shù)

22PCNA與乳腺癌組織類型及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系(表1)在80例乳腺癌標(biāo)本中，PCNA的陽性表達(dá)率為6375%(51/80)。其中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移且PCNA陽性表達(dá)的為39例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移且PCNA陽性表達(dá)的為12例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組PCNA陽性表達(dá)率顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(P001)，且呈正相關(guān)(P001)，即淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度越低，PCNA陽性表達(dá)率亦越低。組織類型與PCNA陽性表達(dá)率呈正相關(guān)(P005)，即腫瘤惡性程度越高，PCNA陽性表達(dá)率亦越高，但各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P005)。

23PCNA表達(dá)和端粒酶活性之間的關(guān)系(表2)端粒酶活性與PCNA表達(dá)具有一致性(χ2=3926，P001)，且呈正相關(guān)(rs=0643,P001)，即端粒酶活性陽性表達(dá)率高，PCNA陽性表達(dá)率亦高。一致率為8625%［(46+23)/80］。

表2PCNA表達(dá)和端粒酶活性之間的關(guān)系（略）

3討論

研究表明，幾乎所有的永生細(xì)胞和絕大部分惡性腫瘤組織均有明顯的端粒酶活性，而正常細(xì)胞、部分良性腫瘤組織和非永生細(xì)胞系中則無或僅有極低的端粒酶活性〔4〕。本研究結(jié)果顯示，乳腺癌患者癌組織標(biāo)本端粒酶陽性表達(dá)率顯著高于乳腺癌相應(yīng)癌旁組織和乳腺良性病變組織，而乳腺良性病變組織中無端粒酶活性的表達(dá)。端粒酶陽性表達(dá)與腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)。上述結(jié)果與俞喬〔5〕報(bào)道一致。有文獻(xiàn)報(bào)道〔6〕，瘤細(xì)胞增殖活性高者，PCNA高表達(dá)，易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，說明PCNA過度表達(dá)增加了瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)性。本研究結(jié)果顯示，PCNA陽性表達(dá)率在乳腺癌淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移組與淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移組分別為750%和4286%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P001)；且PCNA陽性表達(dá)率與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況呈正相關(guān)(P001)。PCNA陽性表達(dá)率與乳腺癌組織類型間雖呈一定的正相關(guān)(P005)，但各組間PCNA陽性表達(dá)率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P005)，可能與本次研究樣本量較少有關(guān)。另外，本結(jié)果顯示，端粒酶活性與PCNA表達(dá)具有一致性且呈正相關(guān)，說明端粒酶活性陽性表達(dá)率高，PCNA陽性表達(dá)率亦高，2者具有協(xié)表達(dá)的關(guān)系，臨床上可將端粒酶檢測及PCNA表達(dá)結(jié)合起來，為指導(dǎo)治療或預(yù)測預(yù)后提供輔助依據(jù)；同時(shí)通過阻斷端粒酶活化亦可達(dá)到預(yù)防和治療腫瘤的目的。

參考文獻(xiàn)

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