導語：如何才能寫好一篇微生物多樣性分析方法，這就需要搜集整理更多的資料和文獻，歡迎閱讀由公務員之家整理的十篇范文，供你借鑒。

篇1

煙草青枯病是煙草的重要病害之一，幾乎分布于世界上所有的烤煙種植區(qū)，其中熱帶和亞熱帶煙區(qū)發(fā)病尤為嚴重［1］。在我國，煙草青枯病是危害南方煙區(qū)煙葉生產(chǎn)的主要病害，一旦發(fā)病往往會造成整株死亡，造成重大經(jīng)濟損失［2-3］。目前，在煙葉生產(chǎn)過程中盡管采用化學藥劑防治［4-6］、生物防治［7-9］、合理輪作［8，10-11］、種植抗病品種［12-14］、調(diào)整土壤微生物和調(diào)整煙苗移栽期等綜合措施來防治煙草青枯?。?5］，但仍無法有效控制該病的發(fā)生。在煙草青枯病生物防治研究方面，目前主要是利用青枯菌的拮抗微生物來防治煙草青枯病，雖然篩選拮抗微生物及其在實驗室或溫室中拮抗試驗效果不錯的研究報道較多［16-18］，但是在大田生產(chǎn)上卻鮮有應用成功的報道。主要原因之一是植煙土壤是一個復雜的生態(tài)系統(tǒng)，耕作層土壤中微生物眾多，包含細菌、真菌和病毒等,其微生物的多樣性和復雜性對青枯菌的拮抗微生物定殖和擴繁有一定影響。因此，分析煙草青枯病土壤中微生物的群落結構，將有利于拮抗微生物的定殖、擴繁和拮抗作用的發(fā)揮。目前，對土壤微生物群落的分析，尤其是快速分析非常困難［19］，隨著分子生物學和生物信息學的快速發(fā)展以及PCR（PolymeraseChainReaction）技術的日趨成熟，一些建立在PCR技術基礎上的分子生物學分析方法如變性梯度凝膠電泳（denaturinggradientgelelectrophoresis,DGGE）［20］、末端限制性片段多態(tài)性（terminalrestrictionfragmentlengthpolymorphism,T-RFLP）和16S保守區(qū)域片段文庫的構建［21］等技術已經(jīng)發(fā)展起來。這些方法不需要培養(yǎng)、分離和純化微生物，也不受微生物是否可在實驗室培養(yǎng)的限制,解決了傳統(tǒng)微生物多樣性分析中的一些分離培養(yǎng)方面的問題。本研究利用微生物保守區(qū)域片段文庫構建，初步分析了煙草青枯病土中細菌、真菌的多樣性，旨在為利用青枯病拮抗菌有效防治該病害提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料煙草青枯病土壤取自貴州省煙草科學研究所福泉煙草青枯病病圃。五點混合法采集土壤樣品，取土壤表層8~20cm的土層，過0.2mm篩，去除雜質。微生物保守區(qū)域片段的擴增引物（表1）由上海生工生物有限公司合成；瓊脂糖凝膠回收試劑盒、DNAMarker、dNTPs、DNA聚合酶、連接酶、克隆載體等試劑購自大連寶生物（TAKARA）有限公司；序列測定由上海生工生物有限公司完成。

1.2方法

1.2.1土壤總DNA的提取和檢測采用玻璃珠均質和液氮研磨法相結合以及SDS-CTAB法，提取病圃土壤中微生物DNA，用純化試劑盒純化獲得DNA。采用瓊脂糖凝膠電泳法檢測土壤微生物總DNA和PCR擴增產(chǎn)物。

1.2.2PCR擴增與DNA純化以土壤微生物總DNA為模板，8f，926r；338F，518R為引物對進行PCR擴增。反應體系總體積為25.0μL，其中模板（土壤DNA）1.0μL，正向引物和反向引物（10μmol/μL）各1.0μL，10×PCRBuffer（含有Mg2+）2.5μL，dNTP（2.5mmol/μL）1.0μL，Taq（5U/μL）0.2μL，蒸餾水補體積至25.0μL；反應程序：95℃預變性5min；94℃變性40s，55℃變性50s，72℃延伸1min，32個循環(huán)；最后，72℃延伸10min。按照TAKARA公司凝膠回收試劑盒說明書操作，對PCR擴增產(chǎn)物進行回收，用瓊脂糖凝膠電泳檢測回收產(chǎn)物。

1.2.3微生物多樣性初步分析保守區(qū)域文庫中檢測為陽性的單克隆由上海生工生物公司測序。獲得的序列信息通過NCBI數(shù)據(jù)庫(ncbi.nlm.nih.gov)及EzTaxon網(wǎng)站()進行在線分析和比對。

2結果與分析

2.1煙草青枯病土壤微生物總DNA提取瓊脂糖凝膠電泳檢測提取純化后的土壤微生物總DNA，結果顯示提取的DNA大小約在2.0~10.0kb范圍之間，通過DNA試劑盒的純化，可以降低土壤中腐植酸以及多酚類等化合物對PCR反應的影響。2.2煙草青枯病土壤微生物16S-rRNA和ITS保守序列文庫構建以純化的DNA為模板，用細菌特異性8f和926r引物、真菌特異性338F和518R引物，經(jīng)過PCR擴增，獲得與預期片段大小一致的條帶，分別在1000bp和300bp左右。分別用8f，926r引物；338F，518R引物擴增的產(chǎn)物構建文庫，從文庫中隨機挑取部分單菌落，用PCR方法檢測其攜帶的片段，部分瓊脂糖電泳檢測結果如圖所示，圖1表明隨機挑取的大多數(shù)單菌落攜帶有目的條帶。陽性克隆的序列的測定由上海生工生物有限公司完成。

2.3煙草青枯病土壤細菌類和真菌類微生物的多樣性煙草青枯病土壤中獲得的細菌類信息如表2所示，結果顯示，土壤中含有假單胞桿菌屬類和鞘氨醇桿菌類等豐富細菌類微生物種類，其中包含部分不可培養(yǎng)假單胞桿菌、芽孢菌等細菌，還有部分序列通過比對沒有獲得相似性比較高的信息。表3結果顯示煙草青枯病土壤中真菌類包括黑霉菌，腐質霉屬真菌，尖孢鐮刀菌及一些不可培養(yǎng)的真菌，其中霉菌類和不可培養(yǎng)的真菌類包括的菌類比較豐富。

篇2

關鍵詞：土壤類型；煙田土壤微生物；根土比；多樣性指數(shù)

中圖分類號：S154 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）01-0056-04

土壤微生物是陸地生態(tài)系統(tǒng)中最豐富的物種，相關研究表明，每克農(nóng)田土壤擁有的基因組量為140～8 800個，相當于400～26 000個不同物種。土壤微生物組成與活性決定了生物地球化學循環(huán)、土壤有機質的周轉及土壤肥力和質量，也與植物的生產(chǎn)力有關。土壤微生物還可以敏感地指示氣候和土壤環(huán)境條件的變化，土壤微生物參數(shù)可能是最早用于反映土壤質量的指標。土地利用方式、種植制度、農(nóng)地管理方式及作物種類都會對土壤微生物產(chǎn)生影響[1-3]。Waldrop等[4]在研究森林轉換為耕地條件下的土壤微生物群落結構時發(fā)現(xiàn)土壤中有機碳和氮下降了50%～55%，微生物量下降了75%，β-葡萄糖苷酶活性下降了54%，微生物特征和種類發(fā)生明顯的變化。

土壤類型對微生物生長發(fā)育有著較大影響。土壤類型不同，土壤微生物種群數(shù)量和組成也必然會存在某種程度的差別，這種差異反過來又會對土壤結構以及土壤肥力特別是對煙草的生長產(chǎn)生一定的影響[5]。土壤微生物是土壤中動植物殘體分解的主要推動者，在土壤物質轉化中具有多種重要作用，與土壤肥力和植物營養(yǎng)有密切關系。因此土壤微生物是反映土壤供肥能力、土壤健康狀況的敏感性參數(shù)。為此，在湖北省?？悼h和興山縣選取兩種有代表性的土壤類型，研究不同類型土壤中主要微生物類群數(shù)量的變化規(guī)律，為合理利用土地資源、保證其可持續(xù)發(fā)展提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

試驗于2009年5～12月在湖北省?？悼h和興山縣進行。選取黃棕壤和紫色土兩種土壤類型，育苗、肥水管理、病蟲害防治及其他田間管理均按照當?shù)剞r(nóng)民種植習慣進行。供試煙草品種為K326。

1.2 土壤樣品采集

分別于移栽前期（5月12-13日）、旺長期（7月8-9日）及采收期（8月15-16日）取樣。采用5點取樣法采集5～20 cm根際土和非根際土，用無菌自封袋包裝，立即帶回實驗室。將新鮮土樣研磨過2 mm篩存放在4 ℃冰箱中。

1.3 土壤微生物測定

采用稀釋平板法測定土壤微生物總數(shù)；細菌采用牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基；固氮菌采用阿須貝氏瓊脂培養(yǎng)基；放線菌采用高氏1號培養(yǎng)基；真菌采用馬丁氏（Martin）培養(yǎng)基。結果以每克干土所含微生物數(shù)量表示[6]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

根土比（R/S）是指根際土中微生物數(shù)量與非根際土中微生物數(shù)量的比，其中R表示根際土中微生物數(shù)量，S表示非根際土中微生物數(shù)量。

微生物數(shù)量變化速率是指根際土中微生物數(shù)量與移栽前期根際土中微生物數(shù)量的比。

生物多樣性指數(shù)是描述生物類型數(shù)和均勻度的一個度量指標，它在一定程度上可反映生物群落中物種的豐富度及其各類型間的分布比例。本研究中土壤微生物菌群多樣性指數(shù)和土壤微生物菌群的均勻度計算方法如下：

1）土壤微生物菌群多樣性指數(shù)（Shannon-Wiener指數(shù)[7]）：H=-∑Pi×1nPi

2）土壤微生物菌群的均勻度[8]：

R=（-∑Pi×1nPi）/1nS

式中，Pi=Ni/N為某群落中第i個類型的個體數(shù)占總個體數(shù)的百分比，S為微生物類群數(shù)量。

2 結果與分析

2.1 不同類型煙田土壤中微生物數(shù)量

由圖1至圖4可知，在不同土壤類型煙田土壤中4種微生物數(shù)量從多到少依次為：細菌、固氮菌、放線菌、真菌。其中，細菌數(shù)量最多，占微生物總量的58.77%～82.98%，固氮菌占微生物總量的10.80%～32.75%，放線菌占微生物總量的3.79%～10.39%，真菌數(shù)量最少，占微生物總量的0.04%～0.22%。由此可見細菌在煙田土壤微生物中占絕對優(yōu)勢。

在不同生育時期不同土壤類型的煙田土壤中，旺長期細菌數(shù)量高于采收期，?？悼h黃棕壤和紫色土煙田旺長期土壤中細菌數(shù)量分別為11.740 2×107 cfu/g和11.654 2×107 cfu/g，興山縣黃棕壤和紫色土煙田旺長期土壤中細菌數(shù)量分別為29.437 0×107 cfu/g和11.295 9×107 cfu/g。

不同類型的煙田土壤中，黃棕壤中細菌和固氮菌數(shù)量均高于紫色土，?？悼h黃棕壤煙田旺長期土壤中細菌和固氮菌數(shù)量分別為11.740 2×107 cfu/g和24.033 4×106 cfu/g，?？悼h紫色土煙田旺長期土壤中細菌和固氮菌數(shù)量分別為11.654 2×107 cfu/g和15.163 0×106 cfu/g；?？悼h黃棕壤煙田采收期土壤中細菌和固氮菌數(shù)量分別為11.250 4×107 cfu/g和34.551 7×106 cfu/g，?？悼h紫色土煙田采收期土壤中細菌和固氮菌數(shù)量分別為10.302 8×107 cfu/g和31.938 6×106 cfu/g。興山縣黃棕壤煙田旺長期土壤中細菌和固氮菌數(shù)量分別為29.437 0×107 cfu/g和99.007 3×106 cfu/g，興山縣紫色土煙田旺長期土壤中細菌和固氮菌數(shù)量分別為11.295 9×107 cfu/g和32.766 6×106 cfu/g；興山縣黃棕壤煙田采收期土壤中細菌和固氮菌數(shù)量分別為16.694 6×107 cfu/g和66.275 2×106 cfu/g，興山縣紫色土煙田采收期土壤中細菌和固氮菌數(shù)量分別為7.679 0×107 cfu/g和23.956 8×106 cfu/g。

2.2 不同類型煙田土壤中微生物數(shù)量變化速率

以移栽前期根際土中微生物數(shù)量為參照，不同類型煙田土壤中微生物數(shù)量變化速率如圖5和圖6所示，黃棕壤中細菌、固氮菌、放線菌和真菌的變化速率都高于1，表明在煙草生長過程中黃棕壤煙田土壤中細菌、固氮菌、放線菌和真菌數(shù)量在增加，而紫色土中固氮菌和放線菌的變化速率存在低于1的情況，表明在煙草生長過程中紫色土煙田土壤中固氮菌和放線菌數(shù)量存在減少的趨勢。

在黃棕壤煙田土壤中，細菌變化速率高于固氮菌變化速率，固氮菌變化速率高于放線菌變化速率，放線菌變化速率高于真菌變化速率。在興山縣黃棕壤煙田旺長期土壤中，細菌、固氮菌、放線菌和真菌的變化速率分別為6.895 5、4.161 8、2.561 1和1.529 9。

在不同類型煙田土壤中，黃棕壤煙田土壤中細菌變化速率、固氮菌變化速率、放線菌變化速率和真菌變化速率分別高于紫色土中4種微生物變化速率。興山縣黃棕壤煙田采收期土壤中，細菌、固氮菌、放線菌和真菌的變化速率分別為3.910 7、2.785 9、2.659 0和2.136 4，興山縣紫色土煙田采收期土壤中，細菌、固氮菌、放線菌和真菌的變化速率分別為1.636 5、1.527 7、1.583 8和1.911 7。

2.3 不同類型煙田根際土中微生物根土比

由圖7和圖8可知，不同類型土壤中細菌、固氮菌、放線菌和真菌根土比都大于1，表明根際土中細菌、固氮菌、放線菌和真菌數(shù)量均高于非根際土，表現(xiàn)出明顯的根際效應。不同類型煙田土壤中，黃棕壤中固氮菌根土比高于紫色土，興山縣黃棕壤中固氮菌根土比最高，為7.007 1。黃棕壤中4種微生物根土比之和高于紫色土，旺長期?？悼h黃棕壤和紫色土中4種微生物根土比之和分別為5.958 3和4.820 9，旺長期興山縣黃棕壤和紫色土中4種微生物根土比之和分別為13.852 2和6.742 4。

2.4 不同類型煙田土壤中微生物種群結構變化

細菌與真菌數(shù)量的比值（B/F）是表征土壤肥力的一個潛在指標。有資料表明，土壤中細菌密度高，表明土壤肥力水平較高。表1為不同土壤類型煙田土壤中微生物的B/F變化趨勢。黃棕壤煙田土壤中旺長期細菌與真菌數(shù)量的比值（B/F）高于采收期，興山縣黃棕壤煙田土壤中旺長期和采收期細菌與真菌數(shù)量的比值（B/F）分別為26.431 4和11.541 7。不同類型煙田土壤中，黃棕壤中細菌與真菌數(shù)量的比值（B/F）幾乎都高于紫色土，興山縣黃棕壤中旺長期細菌與真菌數(shù)量的比值（B/F）最高，為26.431 4。黃棕壤煙田土壤中細菌與真菌數(shù)量的比值（B/F）高于紫色土，表明黃棕壤煙田土壤更適合煙草種植。

2.5 不同土壤類型對土壤微生物多樣性指數(shù)的影響

土壤微生物菌群多樣性指數(shù)（H）反映微生物群落的豐富度，用根際土中微生物菌群多樣性指數(shù)與非根際土中微生物菌群多樣性指數(shù)之比（R/S）衡量煙葉種植對煙田生態(tài)系統(tǒng)中微生物多樣性指數(shù)的影響。從表2可知，黃棕壤根土比大于紫色土。?？悼h黃棕壤和紫色土根土比分別為0.887 18和0.748 94，興山縣黃棕壤和紫色土根土比分別為1.019 26和0.866 43。

3 小結

對不同類型的煙田土壤中細菌、固氮菌、放線菌和真菌進行分離，對不同微生物種群進行數(shù)量和多樣性分析。結果表明，不同類型煙田根際土壤中，黃棕壤中細菌和固氮菌數(shù)量均高于紫色土。在黃棕壤煙田土壤中，細菌變化速率高于固氮菌變化速率，固氮菌變化速率高于放線菌變化速率，放線菌變化速率高于真菌變化速率。黃棕壤煙田土壤中細菌、固氮菌、放線菌和真菌變化速率分別高于紫色土中4種微生物變化速率。黃棕壤中4種微生物根土比之和高于紫色土，興山縣黃棕壤中固氮菌根土比最高。黃棕壤中細菌與真菌數(shù)量的比值（B/F）幾乎都高于紫色土，興山縣黃棕壤中旺長期細菌與真菌數(shù)量的比值（B/F）最高，為26.431 4。黃棕壤根際土中微生物菌群多樣性指數(shù)與非根際土中微生物菌群多樣性指數(shù)之比高于紫色土。

參考文獻：

[1] ZELLES L.Fatty acid patterns of phospholipids and lipopolysaccharides in the characterization of microbial communities in soil：A review[J]. Biol Fert Soils，1999，29（11）：111-129.

[2] LARKIN R P， HONEYCUTT C W. Effects of different 3-year cropping systems on soil microbial communities and rhizoctonia diseases of potato[J]. Phytopathology，2006，96（1）：68-79.

[3] YAO H， HE Z， WILSON M J， et al. Microbial biomass and community structure in a sequence of soils with increasing fertility and changing land use[J]. Microb Ecol，2000， 40（3）：223-237.

[4] WALDROP M P，BALSER T C，F(xiàn)IRESTONE M K. Linking microbial community composition to function in a tropical soil[J]. Soil Biol Biochem，2000，32（2）：1837-1864.

[5] 習金根，孫光明，陸新華.不同的施肥方式對劍麻施肥區(qū)域土壤微生物類群的影響[J].中國麻業(yè)，2005，27（5）：235-239.

篇3

長期大量施用化肥、農(nóng)藥,導致土壤板結,易缺氧,土壤酶活性及微生物多樣性降低。近年來,上海都市農(nóng)業(yè)生產(chǎn)發(fā)展迅速,尤其是蔬菜生產(chǎn),在實際生產(chǎn)中,大部分菜農(nóng)為了片面追求高產(chǎn)而忽視品質,大量使用化肥,特別是氮肥的過量施用現(xiàn)象非常普遍。然而,近年來國家統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示,我國農(nóng)業(yè)資源消耗,包括化肥、農(nóng)藥等的用量增長速率與農(nóng)業(yè)增產(chǎn)量不呈正比,并導致品質下降[14]。相關研究調(diào)查顯示,這些化肥的利用率僅為35%左右,其余未被利用的大部分都變成了污染源,造成水體、空氣和土壤污染等環(huán)境問題[58]。為了解決農(nóng)作物高產(chǎn)與化肥過量施用而引起環(huán)境污染之間這一突出矛盾,農(nóng)業(yè)部都市農(nóng)業(yè)(南方)開放重點實驗室開展了長期的農(nóng)田污染源頭控制與過程治理的研究工作,并且創(chuàng)新開發(fā)出了一種農(nóng)用功能微生物菌劑。本試驗以該微生物菌劑為試驗材料,應用于葉菜類菠菜,探討化肥減量化技術對菠菜營養(yǎng)吸收利用的影響,研究微生物菌劑對菠菜的促生效應,并應用PCR-DGGE(變性凝膠梯度電泳)等現(xiàn)代分子生物學的手段[89],研究化肥減量與微生物菌劑配施處理方式對土壤微生物種群多樣性的影響,旨在為從源頭控制農(nóng)業(yè)面源污染,保護水源地生態(tài)健康,減少化肥用量,推廣環(huán)保節(jié)能的農(nóng)用混合微生物菌劑提供理論基礎和試驗參考。

1材料與方法

1.1供試材料與試驗設計

供試菠菜品種為河北佳禾種子公司提供的大葉菠菜;供試菌劑由河北省科學院微生物研究所提供的硅酸鹽菌劑和上海交通大學農(nóng)業(yè)部都市農(nóng)業(yè)(南方)重點開放實驗室分離純化培養(yǎng)的自生固氮菌液,二者進行混合培養(yǎng)而形成的混合菌液。該混合菌液具有溶磷、解鉀及固氮等功能,主要菌株為Paenibacillusmucilaginosus和Bacillussubtilis,有效活菌數(shù)大于2×108cfu•mL1。選用直徑30cm、高30cm的花盆。試驗前每處理每盆等量施用30.55g有機肥,有機肥的有機質含量≥400g•kg1,N、P、K含量≥80g•kg1,含N43.6g•kg1,含水率27.55%,pH7.85,Cd含量7.23mg•kg1,Pb含量78.24mg•kg1,Cr含量116.43mg•kg1,As含量54.23mg•kg1。有機肥與土壤拌勻。本試驗共設6個不同處理,每處理設3個重復(見表1)。菠菜定植密度為7株•盆1。試驗所用氮肥為尿素,磷肥為過磷酸鈣,鉀肥為硫酸鉀以及上海雨霖牌生物有機肥料。第1季菠菜從2010年11月20日播種開始,到2011年1月24日收割結束;第2季從2011年3月8日到2011年5月5日。供試土壤采自上海交通大學農(nóng)業(yè)與生物學院試驗田,土壤類型為褐壤土,試驗前土壤理化性質背景指標測定如下:土壤全氮、有效磷、速效鉀、有機質含量分別為1.117g•kg1、0.212mg•kg1、125.00mg•kg1、12.40g•kg1,電導率(Ec值)為1.84mS•cm1,pH為7.25。試驗期間人工澆水,根據(jù)菠菜不同生長期的需要,每1~5d澆水1次。

1.2菠菜測定分析

在第1季菠菜六葉期(2010年12月20日14:00)和營養(yǎng)生長后期(2011年1月24日14:00),每盆隨機抽取3株,挑選每株新長出的成熟葉片,使用SPAD-502儀測定葉綠素含量SPAD1和SPAD2。2011年1月14日下午,用OSI-FL葉綠素熒光儀、經(jīng)暗適應30min后,測定菠菜葉片葉綠素熒光參數(shù),每處理9次重復。2011年1月24日,菠菜收割當天,用紫外分光光度法測定菠菜可食部分硝酸鹽含量,每樣品3次重復。電子天平計量菠菜收割產(chǎn)量,每盆單獨收割測產(chǎn);菠菜N、P、K含量由上海交通大學分析測試中心測定,其中N使用Elementer公司元素分析儀(EAI)測定,P、K使用離子光譜儀(ICP)分析測定,每個樣品3次重復。

1.3土壤樣品采集與處理

試驗期間,分別在菠菜六葉期(2010年12月20日)和營養(yǎng)生長后期(2011年1月24日)兩次采集土樣。使用不銹鋼取土器采集0~15cm土層,部分土壤放于20℃冰箱冷凍保存,另一部分土壤樣品風干后研磨,分別過2mm篩和0.45mm篩,塑料袋封裝保存,待測。

1.4土壤微生物分析

1.4.1土壤總DNA的提取、16SrDNAV3區(qū)片段PCR擴增

每個樣品取0.5g土樣提取DNA,本試驗采用Omega公司生產(chǎn)的soilDNAKit提取土壤微生物基因組DNA,按試劑盒使用說明的操作步驟進行。將純化后的基因組DNA作為聚合酶鏈反應(PCR)的模板。采用微生物16SrDNA基因V3區(qū)具有特異性的引物對F341GC和R517,其序列分別為:（略）。GC夾(下劃線)的目的是為了防止在DGGE過程中,引物的完全分離的擴增。反應體系為50μL,PCR反應采用降落PCR策略,即:預變性條件為96℃5min,前20個循環(huán)為94℃1min,65~55℃1min和72℃3min(其中每個循環(huán)后復性溫度下降0.5℃),后10個循環(huán)為94℃1min,55℃1min和72℃3min,最后在72℃下延伸7min。PCR反應的產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4.2DGGE和染色

采用DcodeTM突變檢測系統(tǒng)(CBS)對16SrDNAV3區(qū)擴增產(chǎn)物進行DGGE分析。使用梯度膠制備裝置,變性劑濃度從30%到60%(100%的變性劑為7mol•L1的尿素和40%的去離子甲酰胺),聚丙烯酰胺凝膠濃度為8%;在150V的電壓下,上樣量為18μL。其運行條件為:0.5×TAE電泳緩沖液,60℃電泳條件下,150V,10h。電泳完畢后,再用去離子水漂洗,固定15min,染色15min,顯色10min。在圖像處理過程中,對于在DGGE電泳圖上是肉眼可見、但被軟件忽略掉的一些小條帶進行了手動處理,條帶的密度由該軟件自動算出。

1.4.3指紋圖譜的處理與分析

基于PCR-DGGE的基本原理,所擴增的DGGE條帶的數(shù)量可代表群落DNA序列的豐富度(S),群落DNA序列的多樣性可采用Shannon-Weaver指數(shù)及其均勻度指數(shù)來表示,Shannon-Weaver指數(shù)及其均勻度指數(shù)計算公式為:（略）。

1.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用Excel2003及SPSS13.0進行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析,用單因素方差分析及鄧肯檢驗(DMRT)對數(shù)據(jù)進行顯著性差異分析。采用Bio-rad公司Quantityone軟件的UPGAMA程序進行微生物群落的聚類分析。

2結果與分析

2.1菌劑處理對菠菜生長特性和產(chǎn)量的影響

2.1.1對菠菜營養(yǎng)狀態(tài)的影響

通過對菠菜葉片葉綠素含量進行測定結果顯示(表2),不同施肥處理間差異明顯。各處理相比,就兩次測定的葉綠素含量的變化,T2、T3、T4、T5處理增幅較大,其中T1增加24.2%,而T5則達到45.6%。最后測定各處理的葉綠素含量差異為:T5>T4>T2>T3>T1>>CK。結果說明,化肥對葉綠素合成量的影響在菠菜生長前期影響更為明顯,且常規(guī)化肥處理(T1)為最大;而在生長后期,隨著微生物菌劑在環(huán)境中的定植與適應,在土壤中繁殖量顯著提高,活性顯著增強,對菠菜的作用逐漸顯現(xiàn),相反,化肥的作用卻呈下降趨勢,從而導致最終化肥減量20%和40%的處理比完全用化肥的葉綠素含量要高?？梢?化肥作為速效性肥料對菠菜生長影響較快,作用時間較短,成本較高;而菌劑與化肥的混施,不但更能提高葉綠素含量,且作用時間長,成本也更低。Fv/Fm指標反映菠菜葉綠素熒光動力學參數(shù),是葉片光合系統(tǒng)II原初光能轉換效率,即可變熒光產(chǎn)量與最大熒光產(chǎn)量之比。測定結果顯示,相比對照處理,使用菌劑的T2、T3、T4和T5處理的Fv/Fm都有所提高,其中T3達到0.797,比對照提高0.012,處理間差異顯著。由此可見,菌劑處理的菠菜在營養(yǎng)生長中的光能轉化能力優(yōu)于不施肥CK。添加微生物菌劑的處理與純粹使用化肥的T1處理差異不顯著。菠菜對化肥及土壤中N、P、K等養(yǎng)分的吸收直接表現(xiàn)為各元素在植株體內(nèi)的含量。由表2可知,在收割期,各處理間菠菜N含量存在顯著差異。以T2和T3最高,T5和T4次之,CK處理最低,且T2處理較CK處理的增幅為100%。由此可見,菌劑處理后,固氮菌提高了植株N含量,也就是提高了N吸收,減少了N損失。菠菜收割后植株P、K含量以T1處理為最低,分別約為35.3g•kg1和56.5g•kg1,且明顯低于CK的45.8g•kg1和69.9g•kg1,表明在生長后期,T1處理的菠菜對P、K的吸收較少,土壤中有效磷和速效鉀含量低。相比T1處理,T2和T5處理反而有所提高,表明硅酸鹽菌的溶磷、解鉀作用促進了菠菜對P的吸收利用量,使菠菜P含量較純化肥處理的T1要高。微生物菌劑的兩種菌各自發(fā)揮了其主要功能,固氮菌保持了較低氮肥使用條件下的高N含量,硅酸鹽菌確保了較低磷肥和鉀肥使用條件下的高P、K含量。

2.1.2對菠菜硝酸鹽含量的影響

收割后將菠菜全株(包括根、莖、葉)搗碎后測定硝酸鹽含量。由表3可知,與不施肥(CK)處理相比,施肥處理對菠菜硝酸鹽含量影響較大,使硝酸鹽含量顯著增加。其中,T1處理的硝酸鹽增量最為明顯,達到5866.52mg•kg1,T2最小,為4358.23mg•kg1,T3、T4和T5處理在4677.55~5078.25mg•kg1之間。由此可見,T2、T3、T4、T5處理與T1處理相比,硝酸鹽含量明顯降低。因此,菌劑的配合施用與純施化肥相比,可以提高菠菜品質,有利于生產(chǎn)有機健康蔬菜。

2.1.3對菠菜產(chǎn)量的影響

根系是植物從土壤獲取養(yǎng)分的必要器官,但作為可食用的菠菜,根系重量在菠菜收割期所占總生物量的比重越高(即根生物量比重越高),其可食用部分就相對減少,產(chǎn)量就相對降低。表3表明,固氮溶磷解鉀菌劑配合施用后,與不施肥對照相比,根生物量比重有明顯降低,由4.36%下降到3.02%,降低約30%,比化肥T1處理的3.54%也有降低。由此說明,功能菌劑的配施不僅促進了菠菜根系的生長,而且提高了養(yǎng)分及光合產(chǎn)物的有機分配,從而提高了菠菜可食部分的生物量比重,提高了菠菜產(chǎn)量,有效提高了菠菜的經(jīng)濟效益。本試驗包括兩季菠菜,產(chǎn)量計算為兩季的總產(chǎn)量。其中,第1季為2010年冬季菠菜,第2季為2011春季菠菜。試驗表明,菠菜產(chǎn)量受所施用肥料的影響較大,施肥對菠菜產(chǎn)量提高效果明顯。由表3可知,不同處理間每盆菠菜的平均產(chǎn)量差異顯著。與CK處理相比,T4處理的產(chǎn)量增加最大,每盆平均產(chǎn)量達到277.73g,產(chǎn)量增加170%;T3、T2、T5和T1處理的增產(chǎn)量依次減少,平均每盆產(chǎn)量分別為267.53g、264.38g、241.62g和220.13g。其中,化肥減量施用的T2、T3、T4和T5處理產(chǎn)量均比常規(guī)化肥用量T1處理產(chǎn)量高,達到了化肥減量而不減產(chǎn)甚至增產(chǎn)的效果。由此可見,菌劑可以替代部分化肥,減少農(nóng)業(yè)化肥用量。

2.2菌劑處理對菠菜土壤微生物多樣性的影響

2.2.1土壤微生物DGGE指紋圖譜分析

對不同處理菠菜栽培土壤微生物16SrDNAV3可變區(qū)片斷進行DGGE指紋圖譜分析的結果(圖1a)表明,不同施肥處理下盆栽菠菜土壤的微生物基因區(qū)系條帶出現(xiàn)較小差別。與CK相比,各處理除T1外,條帶亮度略有增加,條帶數(shù)量無明顯差別。從圖1b16SrDNAV3區(qū)PCR擴增片段DGGE泳道圖譜可以看出,多數(shù)的明顯條帶在遷移率上基本一致,說明不同處理間具有大量的共有微生物種群,這主要是存在于試驗土壤中的土著微生物。微生物菌劑處理的明亮條帶明顯在圖譜中部多出現(xiàn)1~2個條帶,表明混合微生物菌劑與化肥的配施,提高了土壤主要微生物種群基因多樣性和數(shù)量。由于試驗在低溫的冬春季進行,土壤微生物本身活性也較低,生長繁殖速率較慢,因而不同施肥制度對微生物種群與數(shù)量的影響反映不夠明顯。

2.2.2土壤微生物DGGE條帶圖譜的聚類分析

不同施肥處理間的土壤微生物種群相似性表現(xiàn)為DGGE條帶聚類分析的相似性系數(shù),相似性系數(shù)越高,種群多樣性越趨于一致,如圖2所示。本試驗中,T4和T5處理間的土壤微生物種群相似性最高,達到0.80,被聚為一類,與T1處理的相似性系數(shù)為0.76,同時與CK都聚在一個大類;而T2和T3處理又被單獨聚在一類,相似性系數(shù)為0.70;兩個大類間最低相似性系數(shù)也達到0.65。一般認為相似值高于0.60的兩個群體具有較好的相似性,將6個樣品歸為一類的相似值達0.65,說明種植1茬菠菜后,不同施肥制度的土壤細菌群落結構相似性程度提高。

2.2.3土壤微生物種群DNA多樣性分析

對不同處理土壤的微生物16SrDNA的DGGE條帶進行香農(nóng)威爾多樣性指數(shù)(Shannon-Wiernerindex)分析,結果見表4。從表4可以看出,豐富度指數(shù)以T1處理最低,T3處理最高,與不施肥處理CK相比,常規(guī)化肥處理T1的土壤細菌豐富度指數(shù)有所降低,而添加微生物菌劑的則有所提高;而Shannon-Wierner指數(shù)在各處理間差異較為明顯,與不施肥處理CK相比,常規(guī)化肥處理T1的土壤細菌多樣性有所降低,而添加微生物菌劑的各處理卻有明顯提高。該結果表明,常規(guī)化肥處理不利于提高土壤微生物種群多樣性;相反,在化肥減量情況下,配施有益的微生物菌劑,有利于改善土壤中主要微生物種群結構,提高微生物種群多樣性。

3討論與結論

篇4

1材料與方法

1.1供試材料

1.1.1供試土壤

供試土壤采自西北農(nóng)林科技大學試驗田,土壤塿類型為土,土壤肥力中等,其主要理化性質為:pH8.32,有機質13.20g•kg1,全氮、全磷、全鉀含量分別為0.79g•kg1、0.61g•kg1和11.14g•kg1,堿解氮、速效磷、速效鉀含量分別為61.03mg•kg1、16.67mg•kg1和154.40mg•kg1。土樣風干、混合均勻后過篩備用。

1.1.2供試肥料

供試肥料包括尿素、磷酸二氫銨、硫酸鉀、有機無機復混肥、生物復混肥。有機肥為將豬糞、小麥秸稈等調(diào)節(jié)到合適的C/N、pH和含水量后經(jīng)高溫堆制發(fā)酵腐熟制作而成,其主要養(yǎng)分含量為N18.6g•kg1、P2O59.0g•kg1、K2O12.2g•kg1。生物復混肥是在有機肥的基礎上加入少量的無機肥,無機肥配比為N4%、P2O52%、K2O3%[10],然后將液體芽孢桿菌復合菌劑(固氮菌Azotobacterchroococcum、解磷菌Bacillusmegaterium、解鉀菌Bacillusmucilaginous由西北農(nóng)林科技大學資源環(huán)境學院微生物實驗室提供,已鑒定各菌株間無拮抗)與蛭石按1∶2混合吸附,均勻摻入上述有機無機復混肥中。有機無機復混肥是添加等量滅菌的蛭石,其中的有機肥、無機肥及其配比均與生物復混肥完全相同。肥料均為自制,配制完成后保存1個月再施用。生物復混肥和有機無機復混肥中氮磷鉀含量均為N55.5g•kg1,P2O518.7g•kg1,K2O36.9g•kg1,有機質360.8g•kg1,功能芽孢桿菌總量為0.21×108cfu•g1。

1.1.3供試作物

供試作物為“鄭單518”玉米,由西北農(nóng)林科技大學種子公司提供。

1.2試驗設計

試驗采用盆栽的方式,于2011年6月在西北農(nóng)林科技大學資源環(huán)境學院玻璃網(wǎng)室中進行。試驗設置對照(CK,不施肥)、無機肥(T1)、有機無機復混肥(T2)、生物復混肥(T3)4個處理,4次重復。生物復混肥按0.20g(N)•kg1(土)施入,其他肥料均按生物復混肥中氮磷鉀的量等量施用。將肥料與12.5kg土樣充分混勻后裝盆,澆透水至土壤含水量為田間最大持水量的60%。玉米催芽后直接播種,出齊苗后間苗,每盆保留3棵,并于定苗1d、15d、30d、45d、60d時采集土壤樣品,在各個處理4次重復內(nèi)隨機取0~20cm的土壤各100g并置于4℃冰箱,用于分析土壤微生物學特性;取玉米生長60d時的土樣在48h內(nèi)進行土壤微生物群落功能多樣性分析。試驗設置保護行,試驗期間根據(jù)實際情況定量澆水,并經(jīng)常更換盆的位置,不同處理的盆栽管理措施均一致。

1.3測定項目和方法

土壤微生物群落功能多樣性分析采用BIOLOGECO測試板進行測定[11]。土壤微生物量碳、氮、磷用氯仿熏蒸提取法測定[1112],采用重鉻酸鉀外加熱法測定提取液中的可溶性碳,采用過硫酸鉀氧化法測定提取液中的總氮,采用NaHCO3浸提鉬銻抗比色法測定提取液中的總磷,土壤微生物量碳、氮、磷的換算系數(shù)分別為0.38、0.54、0.40。

1.4數(shù)據(jù)處理

采用微平板培養(yǎng)96h的數(shù)據(jù)進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析,采用AWCD、Shannon指數(shù)和豐富度指數(shù)來表征土壤微生物群落代謝功能多樣性[8,13]。數(shù)據(jù)經(jīng)Excel2003處理后,采用SPSS16.0軟件進行方差分析和主成分分析,主成分分析采用協(xié)方差矩陣為因子提取依據(jù),其他參數(shù)選取系統(tǒng)默認值。

2結果與分析

2.1生物復混肥對土壤微生物群落功能多樣性的影響

2.1.1土壤微生物群落多樣性指數(shù)分析

土壤微生物群落功能多樣性是土壤微生物群落狀態(tài)與功能的指標,反映了土壤微生物的生態(tài)特征。表1為玉米生長60d時各施肥處理的土壤微生物群落功能多樣性指數(shù),從表1可以看出,BIOLOG微平板培養(yǎng)96h時,T3處理AWCD與其他處理間差異顯著;微生物群落Shannon指數(shù)大小順序為T3>T1>T2>CK,T3處理與其他處理間差異顯著;T3處理土壤微生物群落的豐富度指數(shù)高于其他處理。以上結果表明,生物復混肥處理(T3)可以提高土壤微生物群落的功能多樣性和種群豐富度,有利于提高土壤生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性。

2.1.2土壤微生物對6類碳源的利用

土壤微生物對不同碳源的利用情況反映了土壤微生物的代謝功能類群。從表2可以看出,玉米生長60d時,T1、T2、T3處理土壤微生物群落利用碳源的顯著類型為糖類、羧酸類和氨基酸類,可能是因為這3類碳源是土壤微生物代謝最基本的物質,能夠被大多數(shù)土壤微生物代謝利用。而對于多聚物類、多酚化合物類和多胺類這3類碳源,T3處理與其他處理間差異顯著,表明T3處理的土壤微生物碳代謝群落結構與其他處理有所不同,該處理土壤微生物群落對多酚化合物類的利用明顯高于其他處理,可能是土壤中施入的有機肥在微生物作用下,腐殖化過程中多酚類物質有一定積累,進而激活了能夠利用多酚類物質的微生物的活性,從而提高了土壤微生物對多酚化合物類物質的代謝與利用。土壤中微生物對多酚類物質的利用顯著提高的現(xiàn)象在其他研究中也有出現(xiàn)[14],具體原因還需要進一步研究。

2.1.3土壤微生物群落功能多樣性主成分分析

為清晰地了解不同施肥處理對土壤微生物群落代謝能力的影響,利用培養(yǎng)96h后測定的AWCD數(shù)據(jù)進行主成分分析(PCA)。從表3可以看出,對PC1(第1主成分)貢獻大的碳源(特征向量≥0.50)有17種,其中糖類占35%,羧酸類占24%,影響PC1的主要碳源為糖類,其次為羧酸類和氨基酸類;對PC2(第2主成分)貢獻最大的碳源糖類占50%,其次為羧酸類(25%),因此,對PC1和PC2起分異作用的主要碳源是糖類和羧酸類。與PC1正相關程度較高的碳源有α-D-乳糖和L-精氨酸,負相關的碳源有D,L-α磷酸甘油和吐溫40,不同施肥處理土壤微生物在碳源的利用上既有共同點又有差異,差異可能是由于不同處理土壤微生物群落有所差異,也可能是因為某些碳源是微生物生理代謝途徑中的重要物質[15]。從不同施肥處理土壤微生物群落功能多樣性的主成分分析可以了解各種處理土壤微生物群落功能的相似狀況,結果如圖1所示,PC1方差貢獻率為27.640%,PC2為19.089%。不同處理土壤微生物群落在碳源的利用能力上存在明顯差異,表現(xiàn)在它們在第1、2主成分上得分系數(shù)差異明顯。CK、T1和T2處理的土壤微生物在PC1上的得分值分布一致,與T3處理區(qū)分明顯,T3處理土壤微生物在PC1上的得分值均為正值,CK、T1和T2處理土壤微生物在PC1上的得分值基本為負值;T2處理土壤微生物在PC2上的得分值為正值,而CK和T1處理土壤微生物在PC2上的得分值基本上為負值,較難分開。這表明生物復混肥處理的土壤微生物群落代謝結構與其他處理具有明顯差異,而無機肥和CK處理土壤微生物群落功能相似。施用生物復混肥能提高土壤微生物對不同碳源的代謝能力,提高土壤微生物群落功能多樣性,為土壤提供一個良好的生態(tài)環(huán)境。

2.2生物復混肥對土壤微生物量碳、氮、磷的影響

土壤微生物生物量是土壤有機庫中的活性部分，是存在于土壤微生物體內(nèi)或殘體細胞中可供利用的養(yǎng)分的貯備庫,是土壤養(yǎng)分轉化的動力和中轉站,與土壤中的C、N、P等養(yǎng)分轉化和循環(huán)過程密切相關,反映土壤微生物活動的強弱和養(yǎng)分轉化速率的快慢,從宏觀上反映土壤微生物活性的總體狀況,是土壤生物質量、土壤肥力變化的靈敏指標。研究表明,不同施肥制度對土壤微生物生物量也有顯著影響[1618]。從圖2可以看出,土壤微生物量碳、氮、磷的變化規(guī)律大體一致,土壤微生物量在玉米整個生長期中大致呈先升高后逐漸平穩(wěn)的變化趨勢,與王艷霞等[19]研究結果相似;且土壤微生物量碳、氮、磷的含量均以生物復混肥處理最高,最高值分別為333.21mg•kg1、53.02mg•kg1和22.20mg•kg1。在土壤微生物量碳變化規(guī)律中,生物復混肥處理在玉米生長第30d、45d時較高,并且顯著高于其他處理。生物復混肥處理顯著提高土壤微生物量碳的主要原因可能是生物復混肥中所添加的功能性微生物菌群施入到土壤中,能夠使有益微生物在土壤中形成優(yōu)勢種群,很好地在植物根際成功定殖,發(fā)揮其生態(tài)功能;另一方面,生物復混肥本身帶入的活性有機碳源促進了土壤微生物的繁殖,提高了土壤微生物活性。各處理土壤微生物量氮含量在定苗前期沒有明顯差異,在玉米生長第30d時顯著升高,生物復混肥處理的微生物量氮含量與其他處理相比差異顯著。反映出玉米快速生長期時由于根際活動等促進土壤微生物大量繁殖,生物復混肥處理提高了土壤微生物活性,氮素固定同化到微生物體內(nèi)引起土壤微生物量氮含量升高。土壤微生物量磷的變化規(guī)律與土壤微生物量碳、氮不同,玉米生長前期各處理間差異不明顯,在玉米生長第15d后生物復混肥處理的土壤微生物量磷顯著升高,說明玉米快速生長期間,土壤微生物對土壤中有機態(tài)和無機態(tài)磷的同化作用加大,以微生物量磷的形式存在,土壤中微生物解磷與固磷作用也與土壤中可降解有機物的數(shù)量有關,有機或無機肥料中的磷素對土壤微生物量磷的增加有明顯的貢獻作用[2022]。本試驗土壤微生物量磷的升高趨勢比較穩(wěn)定,與趙蘭鳳等[23]研究結果相似。

3討論

不同施肥措施會導致土壤微生物功能多樣性的系統(tǒng)變化,形成各自特定的土壤微生物種群,長期施用有機肥可明顯增加土壤微生物種群的變異程度[24]。羅希茜等[25]研究稻田土壤微生物群落發(fā)現(xiàn),施用化肥或配施有機肥可使黃泥土土壤微生物的碳源利用率顯著高于對照,有利于維持土壤微生物的碳源利用能力。Wei等[26]研究長期不同施肥處理對黑土細菌群落結構和功能的影響,結果表明無機肥處理與有機無機復混肥處理土壤微生物在單一碳源利用率方面沒有顯著性差異,但在土壤微生物群落結構組成、功能穩(wěn)定性上有差異,施用化學肥料會降低土壤微生物群落的穩(wěn)定性,本研究結果與上述研究結果類似。徐華勤等[27]對茶園土壤微生物群落功能多樣性的主成分分析表明,糖類和羧酸類物質是區(qū)分各處理的主要碳源。本研究主成分分析結果也表明,不同施肥處理土壤微生物功能多樣性差異明顯,起分異作用的主要碳源是糖類和羧酸類。Garland等[28]研究表明,樣本在主成分軸上的分布與微生物對碳源底物的利用能力有關,PC1解釋了大部分的變異,生物復混肥處理分布在PC1的正方向,結合生物復混肥處理對6類碳源的利用,進一步證實生物復混肥處理可提高土壤微生物的代謝能力。土壤微生物功能多樣性變化不僅受施肥影響,還與土壤養(yǎng)分密切相關,但是這方面的研究還較少?？拙S棟等[29]和區(qū)余瑞等[30]的研究表明,土壤有機質和全氮含量與土壤微生物功能多樣性呈正相關。因此,為了全面表征土壤肥力的微生物指標體系,本研究將從土壤微生物多樣性與養(yǎng)分的關系方面進一步探討生物復混肥的施用效果。土壤微生物量能夠快速反映土壤養(yǎng)分含量變化及植物根際活動帶來的土壤微生物活性的變化。Masto等[17]認為微生物熵更能夠反映出土壤微生物活性和土壤有機碳的動態(tài)變化。土壤微生物群落結構的變化可能是導致土壤微生物量變化的首要原因[31]。在本研究中,生物復混肥處理能夠提高土壤微生物群落功能多樣性,其土壤微生物群落結構也比較穩(wěn)定,因此,在玉米快速生長期間生物復混肥處理的土壤微生物量顯著高于其他處理,具有較大的N、P、K中轉代謝庫,能夠為植株提供更多的有效養(yǎng)分。

篇5

[關鍵詞]微生物 分子生態(tài)學 RFLP DGGE Real-Time PCR

[中圖分類號] Q938.1 [文獻碼] B [文章編號] 1000-405X（2015）-2-267-1

0引言

微生物分子生態(tài)學是利用分子生態(tài)技術手段研究微生物與環(huán)境之間相互關系及其相互作用規(guī)律的科學，主要研究微生物生態(tài)學基礎理論問題。

1微生物分子生態(tài)學常用分析方法

1.1寡核苷酸探針檢測

該方法利用目標核酸序列與特異性探針特異性互補的特點，檢測熒光標記的特定DNA序列[1]。探針為一段特定方式標記的核酸序列，具有較高靈敏度。做種群鑒定時選用DNA制備探針，利用cDNA避免繁瑣的克隆程序，確保探針與種內(nèi)全部菌株雜交。除此之外，cDNA探針若具有表型特異性，則可檢測某一特定表型是否存在。

1.2 DNA-DNA雜交

DNA-DNA雜交針對微生物整體基因組的重組[1]，為檢測DNA序列相似性提供可能性。該方法基于高溫雙鏈DNA解鏈、低溫復性與堿基配對可轉移的特點，通過溫度等條件控制形成雜交DNA，檢測其雜交率。由于來源不同的兩條DNA單鍵難以配對重組，DNA雜交率可用于估計序列相似度。

1.3 16SrRNA序列分析

該方法在微生物分類學研究中最為常用[2]。微生物16SrRNA基因由保守區(qū)與可變區(qū)構成?？勺儏^(qū)具有種屬特異性，不同種屬微生物間存在較大差異；保守區(qū)為所有微生物共有基因序列。微生物進化過程中，基因序列基本不變化，因此可根據(jù)保守區(qū)基因序列設計通用引物，或根據(jù)可變區(qū)基因序列設計特定引物，從而分析不同微生物的進化距離及親緣關系。

1.4 編碼蛋白質基因

該方法利用基因序列控制合成蛋白質[3]。微生物代謝過程實質為生物酶催化作用下的一系列氧化還原反應，而不同功能微生物的催化反應酶具有一定特異性，因此編碼功能蛋白的基因不同，主要用于研究特定功能微生物，尤其在毒理學方面。

2微生物分子生態(tài)學常用技術

2.1限制性片段長度多態(tài)性分析（RFLP）

在RFLP分析過程中，以所提取的微生物DNA為模版，利用特異性引物進行聚合酶鏈式反應（PCR）得微生物16SrRNA序列，將其連接到載體，轉至大腸桿菌感受態(tài)細胞，通過挑取克隆子，進而獲取質粒DNA來實現(xiàn)克隆文庫構建。不同微生物DNA序列不同，進而酶切位點不同，因此利用特異性限制性內(nèi)切酶消化，可得到長短不一、數(shù)目不同的限制性酶切片段，瓊脂糖凝膠電泳分離得到呈現(xiàn)多態(tài)性的圖譜，進而獲取環(huán)境微生物群落結構信息[4]。

2.2變性梯度凝膠電泳技術（DGGE）

DGGE是一種檢測DNA突變的電泳技術，根據(jù)DNA在不同濃度的變性劑中解鏈行為的不同而導致電泳遷移率發(fā)生變化，從而將堿基組成不同的DN段分開。該技術具有以下優(yōu)點：①檢測極限低、速度快；②結果準確可靠；③無需微生物的培養(yǎng)；④可同時檢測多種微生物。但其存在以下局限性：無法獲取樣品中全部微生物DNA，而DNA回收率越低，重復性越低；不均等擴增造成結果代表性低；敏感度較低，采樣和樣品處理會對結果產(chǎn)生影響。

2.3熒光定量PCR技術（Real-Time PCR）

Real-Time PCR為微生物生態(tài)學研究的定量分析方法，通過熒光染料或熒光標記的特異性的探針，標記跟蹤PCR產(chǎn)物，實時在線監(jiān)測反應過程，結合相應的軟件分析產(chǎn)物，計算模板濃度。該技術具有以下優(yōu)點：①利用擴增產(chǎn)物數(shù)量與熒光信號強度成對應關系的原理，實時檢測PCR反應進程，避免了終點定量重現(xiàn)性差；②自動化程度高，操作安全、簡單，可避免產(chǎn)物被污染；③檢測特異性強，靈敏度與精確度高；④可實現(xiàn)多重擴增。其缺點在于無法對不確定對象進行分析。

3結論與展望

微生物分子生態(tài)學克服了傳統(tǒng)培養(yǎng)法的不足，為全面掌握微生物多樣性提供了可能。若將各方法結合，以便掌握更為全面的信息，可更好揭示微生物對環(huán)境變化的影響，預示環(huán)境變化趨勢，為從微觀方面改善環(huán)境提供依據(jù)。

參考文獻

[1]楊霞，陳陸，王川慶.16SrRNA基因序列分析技術在細菌分類中應用的研究進展[J].西北農(nóng)林科技大學學報（自然科學版），2008，36（2）：55-60.

[2]鄧小寬，張新宜，田敏.現(xiàn)代生物技術在分子微生物生態(tài)學中的應用[J].國外醫(yī)藥（抗生素分冊），2006，27（4）：164-170.

篇6

關鍵詞：生物多樣性；多樣性功能評價；濕地保護；衡水湖濕地

biodiversity function evaluation of the hengshui lake wetland

zhang xue-zhi

(hengshui bureau for hydrology and water resources survey of hebei province,hengshui 053000,china)

abstract: the hengshui lake wetland,located in the hinterland of north china plain,is a bio-intensive wetland in the north temperate zone,an intersection area for the different migratory birds,and the best habitat in north china plain for many rare and precious birds.according to the survey data of the wetland biodiversity,this study conducted a diversity function evaluation on species diversities and ecosystem diversities in the wetland.according to the wetland biodiversity criteria,the hengshui lake wetland biodiversity is at a general level.biodiversity function evaluation of the wetland we can provide scientific basis for the wetland protection.

key words: biodiversity;diversity function evaluation;wetland protection;the hengshui lake wetland

1 衡水湖濕地屬性

按照國際濕地公約的濕地分類［1］，衡水湖濕地主要為湖泊濕地、沼澤濕地、水體沼澤化濕地、鹽沼濕地、河流濕地和渠道濕地等。其中湖泊濕地、沼澤濕地是濕地的主體，類型與面積占據(jù)主要地位。其他類型濕地居次要地位。此外，還有少量人工濕地如溝渠、養(yǎng)魚池等。各種類型濕地關系十分密切，它們相互依存，共同構成衡水湖濕地生態(tài)系統(tǒng)。任一類型濕地的退化都將對衡水湖濕地的生態(tài)與環(huán)境功能產(chǎn)生巨大的影響［2-4］。

1.1 生物多樣性保護層次

衡水湖具有非常重要的濕地生態(tài)服務功能，是北溫帶野生動植物聚集地和候鳥南北遷徙不同路線的交匯處，這里有植物370種，鳥類286種，魚類26種，昆蟲194種，兩棲爬行類17種，哺乳類17種，生物多樣性非常豐富。

保護生物多樣性和生態(tài)系統(tǒng)功能的完整性與保護珍稀動植物有著同等重要的意義。許多物種雖然未被列入國內(nèi)外各種動植物保護名錄，但其或為重點保護珍稀鳥類提供棲息地和繁殖地，或直接（間接）為這些珍稀鳥類提供食物，共同構成適宜的鳥類生境。所以保護這些物種，保護生物多樣性對于珍稀鳥類的保護也是至關重要的。同時，保護生物多樣性也就是保護濕地這一天然物種基因庫，以利于我們子孫后代對物種資源的可持續(xù)利用，對人類生存和生活也都具有重要的現(xiàn)實和潛在的意義［5］。

1.2 濕地保護類型

濕地是位于陸生生態(tài)系統(tǒng)和水生生態(tài)系統(tǒng)之間的過渡性地帶，在土壤浸泡在水中的特定環(huán)境下，生長著很多濕地的特征植物。濕地廣泛分布于世界各地，擁有眾多野生動植物資源，是重要的生態(tài)系統(tǒng)。很多珍稀水禽的繁殖和遷徙離不開濕地，因此濕地被稱為“鳥類的樂園”。濕地強大的生態(tài)凈化作用，因而又有“地球之腎”的美名。根據(jù)《自然保護區(qū)類型與級別劃分原則》(gb/t 14529-93)，衡水湖國家級自然保護區(qū)屬于自然生態(tài)系統(tǒng)類的濕地類型自然保護區(qū)［6］。從生態(tài)系統(tǒng)特征上看屬于以華北內(nèi)陸淡水濕地生態(tài)系統(tǒng)為主的平原復合濕地生態(tài)系統(tǒng)。

2 濕地生物多樣性功能評價方法

生物多樣性的3個主要層次是物種多樣性、基因多樣性和生態(tài)系統(tǒng)多樣性。這是組建生物多樣性的3個基本層次。基因多樣性代表生物種群之內(nèi)和種群之間的遺傳結構的變異。每一個物種包括由若干個體組成的若干種群。各個種群由于突變、自然選擇或其他原因，往往在遺傳上不同。因此，某些種群具有在另一些種群中沒有的基因突變，或者在一個種群中很稀少的等位基因可能在另一個種群中出現(xiàn)很多。在同一個種群之內(nèi)也有基因多樣性，在一個種群中某些個體常常具有基因突變。生態(tài)系統(tǒng)多樣性既存在于生態(tài)系統(tǒng)之間，也存在于一個生態(tài)系統(tǒng)之內(nèi)。總之，物種多樣性是生物多樣性最直觀的體現(xiàn)，是生物多樣性概念的中心。基因多樣性是生物多樣性的內(nèi)在形式，一個物種就是一個獨特的基因庫，可以說每一個物種就是基因多樣性的載體；生態(tài)系統(tǒng)的多樣性是生物多樣性的外在形式，保護生物的多樣性，最有效的形式是保護生態(tài)系統(tǒng)的多樣性［7-9］。

作為水陸相兼的生態(tài)系統(tǒng)，濕地的獨特生境使它同時兼具豐富的陸生與水生動物植物資源，對于保護物種，維持生物多樣性具有難以替代的生態(tài)價值。濕地生物多樣性是所有濕地生物種種內(nèi)遺傳變異和它們生存環(huán)境的總稱，包括所有不同種類的動物、植物、微生物及其所擁有的基因和它們與環(huán)境所組成的生態(tài)系統(tǒng)［12］。

物種多樣性是群落生物組成結構的重要指標，它不僅可以反映群落組織化水平，而且可以通過結構與功能的關系間接反映群落功能的特征。

在濕地生態(tài)系統(tǒng)評價方法的基礎上，結合生物多樣性的理論和實踐，將物種多樣性和生物多樣性作為一級指標，下設二級、三級亞指標，建立可操作性較強的濕地生物多樣性評價指標體系［13］，見表1。

人類威脅程度分值

對資源保護部構成威脅5保護區(qū)與未開發(fā)生境毗鄰5

資源的有效保護受到一定的威脅3保護區(qū)周邊尚有未開發(fā)生境3

資源的有效保護受到較大的威脅1保護區(qū)被已開發(fā)的區(qū)域環(huán)繞1

根據(jù)濕地生物多樣性現(xiàn)狀調(diào)查結果，對照以上賦值逐項打分，將所得分數(shù)累加即得到該濕地生物多樣性評價總分值。計算公式為：

r=∑3i=1ai+∑3j=1bj(1)

式中：r-濕地生物多樣性總分值；a-物種多樣性分值；i-物種多樣性評價項目數(shù)；b-生態(tài)系統(tǒng)多樣性分值；j-生物多樣性評價項目。

根據(jù)r值的高低，將濕地生物多樣性劃分為5級，見表8。

3 衡水湖生物多樣性評價

衡水湖是華北平原上第一個內(nèi)陸淡水湖國家級自然保護區(qū)，同時也是華北平原唯一保持沼澤、水域、灘涂、草甸和森林等完整濕地生態(tài)系統(tǒng)的自然保護區(qū)［14］。豐富的生物資源是衡水湖的支柱。這里有綠藻、藍綠藻和硅藻等在內(nèi)的201種浮游植物、平均密度達到了4 000個/l，浮游動物174種、平均密度達到了4 000個/l；這里有蘆葦?shù)韧λ参铮?、睡蓮屬等漂浮有葉植物，眼子菜屬、黑藻屬等深水植物；這里有兩棲綱、爬行綱、哺乳綱野生動物共30多種。所以，衡水湖被稱作“物種基因庫”。

根據(jù)調(diào)查結果，衡水湖濕地有維管植物366種，鳥類286種，分別占河北省物種總數(shù)的42.2%和57.2%。維管束植物有國家三級重點保護植物野大豆；鳥類有國家一級重點保護的7種，有黑鸛、東方白鶴、丹頂鶴、白鶴、金雕、白肩雕、大鴇。生物多樣性評價結果為：

物種多度：a1=a11+a12=7.5+10=17.5

物種豐度：a2=a21+a22=10+7.5=17.5

物種稀有性：a3=a31+a32=2+4=6

則物種多樣性為：

a=∑3i=1ai=17.5+17.5+6=41

衡水湖濕地大多數(shù)植物屬于世界廣布種；在調(diào)查的鳥類中，廣布種占總數(shù)的23.1%，古北種占種數(shù)的68.9%，東洋種占8.0%。衡水湖為沼澤蘆葦香蒲生態(tài)系統(tǒng)，在華北屬常見生境類型；生態(tài)系統(tǒng)的組成結構簡單、類型單一。衡水湖受人類影響因素較多，對濕地內(nèi)水體、生物等資源影響較大；濕地周圍為村鎮(zhèn)和農(nóng)田，沒有未被開發(fā)的區(qū)域。生態(tài)系統(tǒng)多樣性評價結果如下。

生態(tài)系統(tǒng)多樣性地區(qū)分布：

b1=b11+b12=4+4=8

生態(tài)系統(tǒng)多樣性生境類型：

b2=b21+b22=2+6=8

生態(tài)系統(tǒng)多樣性人類威脅評分：

b3=b31+b32=1+1=2

則生態(tài)系統(tǒng)多樣性為：

b=∑3i=1bi=8+8+2=18

濕地生物多樣性評價總分為：

r=∑3i=1ai+∑3j=1bj=41+18=59

按照濕地生物多樣性評分標準，衡水湖濕地生物多樣性功能進行評價，評價結果為：物種多樣性為41分，生物系統(tǒng)多樣性為18分，衡水湖濕地生物多樣性處于一般水平［15］。從分析結果可以看出，衡水湖濕地物種多樣性占優(yōu)勢，而生態(tài)系統(tǒng)多樣性占劣勢，生態(tài)環(huán)境受人類活動影響因素較大。

4 結論

利用衡水湖生物多樣性資料，對衡水湖生物多樣性功能進行評價。分別對物種多度、物種豐度和物種稀有性進行分析，計算出物種多樣性；對生態(tài)系統(tǒng)多樣性地區(qū)分布、生態(tài)系統(tǒng)多樣性生境類型和生態(tài)系統(tǒng)多樣性人類威脅等指標分析，計算出生態(tài)系統(tǒng)多樣性指標。按照濕地生物多樣性評分標準，衡水湖濕地生物多樣性處于一般水平。生物多樣性是自然生態(tài)系統(tǒng)生產(chǎn)和生態(tài)服務的基礎和源泉。生物多樣性可提供多方位的服務。人類歷史上大約有3 000種植物被用作食物，估計有75 000種植物可作食用。人類就是依賴這些植物得以繁衍。生物技術是以現(xiàn)有生物多樣性為物質基礎的工作，在解決糧食短缺、人類健康、維護生物物種和環(huán)境等諸多社會經(jīng)濟重大問題中將發(fā)揮重要作用，將成為21世紀國民經(jīng)濟的支柱產(chǎn)業(yè)。

參考文獻：

［1］ 于貴瑞.全球變化與陸地生態(tài)系統(tǒng)碳循環(huán)和碳蓄積［m］.北京：氣象出版社，2003.（yu gui-rui．global change and terrestrial ecosystems carbon cycle and carbon deposition ［m］.beijing:china meteorological press,2003.(in chinese)）

［2］ 歐陽志云，王如松，趙景柱.生態(tài)系統(tǒng)服務功能及其生態(tài)經(jīng)濟價值評價［j］.應用生態(tài)學報，1999，10(5)：635-640．(ouyang zhi-yun,wang ru-song,zhao jing-zhu.the function of ecosystem services and ecological economic value evaluation ［j］.1999,10 (5):635-640.(in chinese)）

［3］ 張學知.衡水湖濕地生態(tài)系統(tǒng)恢復原理與方法［j］.南水北調(diào)與水利科技，2010，8(1)：122-125.（zhang xue-zhi.the hengshui lake wetland ecosystem restoration principle and method ［j］.south-to-north water transfers and water scinenes & technoiogy,2010,8(1):122-125.(in chinese)）

［4］ 馬克平，錢迎倩.生物多樣性保護機器研究進展［j］.應用于環(huán)境生物學報，1998，4(1)：95-99.（ma ke-ping,qian ying-qian.biodiversity protection machine research progress ［j］.journal of applied biological environment,1990,4 (1):95-99.(in chinese)）

［5］ 黃富祥，王躍思.試論生物多樣性保護理論與實踐面臨的困難及現(xiàn)實出路［j］.生物多樣性，2001，9(4)：399-406.（huang fu-xiang,wang yue-si.try to biodiversity conservation in theory and practice,and the practical way to face the difficulties ［j］.journal of biodiversity,2001,9(4):399-406.(in chinese)）

［6］ gb/t 14529-93，自然保護區(qū)類型與級別劃分原則［s］.（gb/t 14529-93,the types and levels principle of nature reserve ［s］.(in chinese)）

［7］ 鞠美婷，王艷霞，孟偉慶，等．濕地生態(tài)系統(tǒng)的保護與評估［m］．北京：化學工業(yè)出版社，2009．（ju mei-ting,wang yan-xia,meng wei-qing,et al.protect and evaluation on wetland ecosystem ［m］.beijing:chemical industry press,2009.(in chinese)）

篇7

關鍵詞：黃瓜；輪作；大蔥；土壤；連作障礙

中圖分類號：S642.2 文獻標識碼：A DOI編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2013.08.008

研究表明，蔬菜連作會導致生長受阻，抗病能力減弱，產(chǎn)品產(chǎn)量和品質下降[1-2]。連作土壤與輪作土壤相比，理化性質變劣[3]，酶活性降低[4]，微生物數(shù)目及種群多樣性減少[5]。黃瓜是設施主栽蔬菜，連作障礙已成為制約其高產(chǎn)高效和可持續(xù)發(fā)展的重要因素。試驗發(fā)現(xiàn)，大蔥輪作可顯著減輕黃瓜連作土壤障礙，促進生長，提高產(chǎn)量[6]，對此，前人從根區(qū)土壤的理化和生物學特性方面進行了探討[6-8]。根際是植物與土壤進行物質和能量交換最劇烈的區(qū)域，根際土壤的理化和生物學特性與非根際土壤明顯不同[9]。本試驗以黃瓜連作土壤為對象，比較研究了大蔥-黃瓜輪作和黃瓜-黃瓜連作兩種栽培模式對后茬黃瓜根際土壤理化和生物學性狀的影響，以期探討大蔥輪作減輕黃瓜連作障礙的機理，為制定合理栽培制度提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材 料

供試土壤取自山東省泰安市岱岳區(qū)房村鎮(zhèn)北滕村，為連續(xù)種植15年黃瓜的日光溫室耕層土壤。土壤類型為棕壤，屬砂壤土，土壤理化性狀為pH 值6.19，EC值 825 μS·cm-1，堿解氮238.0 mg·kg-1，有效磷151.2 mg·kg-1，速效鉀131.2mg·kg-1。

供試黃瓜（Cucumis sativus L.）品種‘新津11號’，大蔥（Allium fistulosum L.）品種‘元藏大蔥’。

1.2 方 法

1.2.1 試驗設計 試驗于2011年8月—2012年6月在山東農(nóng)業(yè)大學園藝試驗站日光溫室內(nèi)進行，設2個處理：大蔥-黃瓜輪作（T），黃瓜-黃瓜連作（CK）。每處理30盆，隨機排放?；ㄅ柚睆?0 cm，高25 cm，內(nèi)裝連作土壤10 kg。裝盆前向土壤中均勻混入復合肥（N∶P2O5∶K2O=15∶15∶15）10 g，生育期不再追肥。黃瓜、大蔥分期播種育苗，2011年8月29日同時定植，黃瓜每盆1株，大蔥每盆5株，12月20日拉秧。

后茬于2012年4月25日全部定植黃瓜，常規(guī)方法管理，6月20日拉秧。

分別于5月15日、5月25日、6月5日取樣。每處理隨機取5盆，利用雷娟利等[10]方法獲得根際土樣，混合均勻，研磨過2 mm篩，一部分于4 ℃冰箱保存，用于土壤微生物分析；另一部分風干后過1 mm篩，用于土壤酶和理化指標分析。

1.2.2 測定方法

（1）土壤理化性狀。pH值按土水比1∶5（W/V）浸提，用雷磁PHBJ-260便攜式pH計測定，EC值按土水比1∶5（W/V）浸提，用雷磁DDB-303A便攜式電導率儀測定；堿解氮采用堿解擴散法測定，有效磷采用碳酸氫鈉浸提-鉬銻抗比色法測定，速效鉀采用醋酸銨浸提-火焰光度法測定[11]。

（2）土壤微生物數(shù)量。細菌采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基培養(yǎng)；放線菌采用改良高氏1號培養(yǎng)基培養(yǎng)（每1 000 mL培養(yǎng)基中加入3%重鉻酸鉀3.3 mL）；真菌采用馬丁氏培養(yǎng)基培養(yǎng)（每1 000 mL培養(yǎng)基中加入1%孟加拉紅水溶液3.3 mL，1%鏈霉素3 mL）。微生物數(shù)量均采用系列稀釋法計數(shù)[12]。

（3） 土壤酶活性。土壤脲酶采用苯酚-次氯酸鈉比色法測定；磷酸酶采用磷酸苯二鈉比色法測定；過氧化氫酶采用高錳酸鉀滴定法測定[13]。

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 采用DPS軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析及最小顯著差異性檢驗。

2 結果與分析

2.1 不同種植模式對黃瓜根際土壤EC值和pH值的影響

伴隨生育期推進，黃瓜根際土壤EC值不斷降低，生育初期輪作黃瓜的根際土壤EC值大于連作黃瓜，但定植40 d后，EC值開始低于連作黃瓜（圖1）。連作和輪作黃瓜根際土壤pH值緩慢升高，輪作黃瓜上升幅度大于連作黃瓜，6月5日輪作黃瓜的根際土壤pH值高于連作黃瓜土壤。

2.2 不同種植模式對黃瓜根際土壤養(yǎng)分含量的影響

由圖2可以看出，根際土中速效氮含量呈先升高后降低趨勢，有效磷和速效鉀含量則持續(xù)降低。生育初期，輪作黃瓜根際土壤中的速效氮、有效磷、速效鉀含量高于連作土壤，盡管有效磷含量未達顯著差異水平，說明前茬大蔥吸收的養(yǎng)分較少。隨著植株生長，輪作黃瓜根際土壤中有效磷含量迅速降低，以致低于連作土壤，速效氮與連作土壤無顯著差異，速效鉀含量卻始終較高。

2.3 不同種植模式對黃瓜根際土壤酶活性的影響

脲酶是土壤中主要的水解酶之一，與土壤中尿素的水解密切相關，其酶促產(chǎn)物氨是植物氮源之一；磷酸酶可加速有機磷的脫磷速度，對土壤磷素的有效性具有重要作用，其活性是評價土壤磷素生物轉化方向與強度的指標；過氧化氫酶促過氧化氫的分解，有利于防止它對生物體的毒害作用，其活性則可以反應土壤中氧化過程的強度[13]。根際土壤中3種酶活性均隨黃瓜生長不斷升高，但輪作黃瓜根際土壤酶活性始終高于連作土壤（圖3），6月5日輪作土壤中脲酶、磷酸酶和過氧化氫酶活性分別是輪作土壤的1.24，1.11，1.27倍，說明輪作有利于提高后茬黃瓜根際土壤酶活性。

2.4 不同種植模式對黃瓜根際土壤微生物群落結構的影響

從圖4可以看出，隨著黃瓜的生長，根際土中細菌、真菌和放線菌數(shù)目均不斷增加，其中，細菌在土壤微生物群落中占絕對優(yōu)勢。根際土壤中細菌、放線菌和真菌數(shù)初期差異不大，后期輪作黃瓜根際土壤中細菌、放線菌數(shù)目顯著高于連作黃瓜，真菌數(shù)則顯著低于連作黃瓜。輪作黃瓜根際土壤中真菌數(shù)占微生物總量的比例低于連作黃瓜，6月5日土壤真菌所占比例分別為0.28%和0.54%。

3 討 論

設施連作障礙的一個重要原因是土壤酸化、次生鹽漬化和養(yǎng)分失衡[14]。合理輪作可以降低土壤鹽分積累，在一定程度上避免次生鹽漬化的發(fā)生[15]。與連作相比，輪作黃瓜的根際土壤EC值降低速度較大，最后低于連作黃瓜根際土壤，可能與輪作植株生長勢較強，吸收土壤中養(yǎng)分較多有關。王柳[16]發(fā)現(xiàn)，在不施肥或只施底肥情況下，黃瓜根區(qū)土壤pH值總體呈上升趨勢。本試驗中，伴隨黃瓜生育，連作和輪作黃瓜根際土壤pH值均呈升高趨勢，可能與只施用了底肥有關。

輪作黃瓜根際土壤中速效氮、有效磷和速效鉀含量前期較高，說明前茬大蔥吸收養(yǎng)分數(shù)量少于黃瓜。伴隨生育進程，黃瓜根際土壤中養(yǎng)分含量快速降低，輪作黃瓜根際有效磷含量低于連作黃瓜，可能因為輪作黃瓜生長旺盛，對磷的吸收較多，同時磷在土壤中移動性較差[17]有關。土壤速效氮含量先升高后降低，可能由于根系生理活動使速效氮在根際發(fā)生了富集。欽繩武等[18] 對氮素在根際遷移規(guī)律的研究中發(fā)現(xiàn)，氮素在旱作根際土壤中會出現(xiàn)富集現(xiàn)象。

土壤酶直接參與土壤中物質的轉化及養(yǎng)分的釋放和固定過程， 與土壤肥力狀況密切相關[19]。本試驗中，大蔥輪作模式下土壤酶活性明顯高于黃瓜連作土壤。吳煥濤等[6]也得出相似的結論。土壤酶活性升高是輪作減輕連作障礙的原因之一。

土壤微生物群落結構的多樣與穩(wěn)定不僅可提高土壤微生態(tài)的穩(wěn)定性，也可提高土壤的緩沖能力[20]。本研究結果表明，輪作黃瓜根際土壤中可培養(yǎng)細菌及放線菌數(shù)目均高于連作黃瓜，可培養(yǎng)真菌數(shù)目則低于連作黃瓜，與楊鳳娟[8]、吳鳳芝[21]研究結果一致，表明輪作可以改變土壤微生物群落結構，改善土壤的微生態(tài)環(huán)境。

本試驗結果表明，大蔥輪作后的黃瓜根際土壤理化及生物學性狀得到明顯改善，可作為防控設施黃瓜連作障礙的一種有效種植模式。

參考文獻：

[1] 吳鳳芝，劉德，欒非時. 大棚土壤連作年限對黃瓜產(chǎn)量及品質的影響[J]. 東北農(nóng)業(yè)大學學報，1999， 30 （3）： 245-248.

[2] 吳鳳芝，劉德，王東凱，等. 大棚番茄不同連作年限對根系活力及其品質的影響[J]. 東北農(nóng)業(yè)大學學報，1997，28 （1）： 33-38.

[3] 郭紅偉，郭世榮，黃保健. 大棚辣椒不同連作年限土壤理化性質研究[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2011， 39 （5）： 452 -455.

[4] 吳鳳芝，孟立君，王學征. 設施蔬菜輪作和連作土壤酶活性的研究[J]. 植物營養(yǎng)與肥料學報， 2006， 12 （4）： 554-558.

[5] Yao H Y， Jiao X D， Wu F Z. Effects of continuous cucumber cropping and alternative rotations under protected cultivation on soil microbial community diversity[J]. Plant Soil， 2006， 284：195-203.

[6] 吳煥濤，魏珉，楊鳳娟，等.輪作和休茬對日光溫室黃瓜連作土壤的改良效果[J]. 山東農(nóng)業(yè)科學， 2008（5）： 59-63.

[7] 李元，司力珊，張雪艷，等. 填閑作物對日光溫室土壤環(huán)境作用效果比較研究[J]. 農(nóng)業(yè)工程學報， 2008， 24 （1）： 224-229.

[8] 楊鳳娟，吳煥濤，魏珉，等. 輪作與休茬對日光溫室黃瓜連作土壤微生物和酶活性的影響[J]. 應用生態(tài)學報， 2009， 20 （12） ：2983-2988.

[9] Wang Z W， Shan X Q， Zhang S Z. Comparison of speciation and bioavailability of rare earth elements between wet rhizosphere soil and air-dried bulk soil[J]. Analytica Chimica Acta， 2001，1（441）：147-156.

[10] 雷娟利， 壽偉松， 董文其，等. 抗感枯萎病西瓜根際微生物比較研究[J].微生物學通報， 2008， 35（7）： 1034-1038.

[11] 鮑士旦. 土壤農(nóng)化分析[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社， 2000 .

[12] 杜秉海. 微生物學實驗[M]. 北京： 北京農(nóng)業(yè)大學出版社， 1994.

[13] 關松蔭. 土壤酶及其研究法[M]. 北京： 中國農(nóng)業(yè)出版社， 1986.

[14] 呂衛(wèi)光，余廷園，諸海濤，等. 黃瓜連作對土壤理化性狀及生物活性的影響研究[J]. 中國生態(tài)農(nóng)業(yè)學報， 2006， 14 （2）： 119-121.

[15] 吳艷飛，張雪艷，李元，等. 輪作對黃瓜連作土壤環(huán)境和產(chǎn)量的影響[J]. 園藝學報， 2008，35（3）：357-362.

[16] 王柳. 京郊日光溫室土壤環(huán)境特征與黃瓜優(yōu)質高產(chǎn)相關性的研究[D]. 北京：中國農(nóng)業(yè)大學， 2003.

[17] Mays D A. Forage Fertilization[M]. Madison： American Society of Agronomy， Crop Science Society of America， Soil Science Society of America， 1974.

[18] 欽繩武， 劉芷宇. 土壤-根系微區(qū)養(yǎng)分狀況的研究Ⅵ.不同形態(tài)肥料氮素在根際的遷移規(guī)律[J]. 土壤學報， 1989， 26（2）： 117-123.

[19] Diamantidis G， Effosse A， Potier P. Purification and characterization of the first bacterial laccasein the rhizospheric bacterium Azospirillum lipoferum[J]. Soil Biology and Biochemistry， 2000，32：919-927

篇8

關鍵詞: A - A - O工藝，變性梯度凝膠電泳，濃度，硝化細菌的結構

Abstract: The experimental use of PCR-DGGE technology to study the impact of the DO concentration of Nitrifying Bacteria in the structure of the AAO process, provide a reliable basis for system optimization.

Keyword: A-A-O process; DGGE; DO Concentration; Nitrifying Bacteria in structure

中圖分類號： U664.9+2 文獻標識碼：A 文章編號：

1引言

大中城市污水處理廠多采用生物方法處理城市生活污水及工業(yè)廢水，該法最主要優(yōu)點是處理效果好，費用低。處理工藝中起主要作用的是生物反應段,活性污泥是生物處理功能主體，通過對活性污泥中微生物群落結構多樣性分析對于在節(jié)約能源的前提下提高污水處理效率具有重要意義。

研究活性污泥中微生物多樣性開始采用PCR-DGGE技術，并取得了較好結果。實驗結合A-A-O工藝,研究好氧反應器內(nèi)DO濃度改變時，相應硝化細菌群落結構變化情況。

2材料和方法

2.1關于A-A-O的設置

裝置工藝參數(shù)如下：進水流量:30L/d;在三個反應池中水力停留時間：1.5h、1.5h、6 h；總回流比:300%；SRT:15天；裝置啟動和運行穩(wěn)定共120天。好氧反應區(qū)DO平均濃度值為0.5、1.5、2.5、3.5、4.5mg/L。

2.2 基因組DNA提取采用SDS裂解法。

2.3 PCR擴增

2.3.1實驗所用引物

AOB菌群所用引物為CTO189fAB/CTO189fC∕CTO653r亞硝化螺菌

所用引物為 P338f∕Ntspa0685硝化桿菌所用引物為 P338f∕Nb1000f

2.3.2 PCR反應體系及反應條件

. PCR反應體系組成: Taq聚合酶0.4μL,10×反應緩沖液5μL，4×dNTP 1μL,引物2μL,模板DNA 1μL,最后加雙蒸水至體積50μL。擴增程序：94℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸1.5 min，重復步驟35次，72℃后延伸8min。

2.4 變性梯度凝膠電泳

2.4.1瓊脂糖凝膠、凝膠板的制備及PCR的加樣

稱瓊脂糖，放入錐形瓶中，再加入緩沖液，置微波爐加熱至完全溶化取出搖勻，待冷卻后，加入EB。 將冷卻瓊脂糖凝膠，倒入制膠板內(nèi)，待凝膠凝固后加入緩沖液。取樣品及緩沖液混合后打入膠板孔。

2.4.2電泳及觀察

電泳電壓為170V，結束后，放入凝膠成像系統(tǒng)內(nèi)拍照。

3實驗結果與分析

DO對A-A-O工藝硝化菌群群落結構影響

(1)DO濃度對AOB群落結構影響

DGGE分離結果如圖3-5所示，得到共有8種AOB細菌，條帶標為AOB1-AOB8。有三條條帶（AOB2、AOB4、AOB6）一直比較穩(wěn)定而且亮度比其他條帶強，所對應菌種為AOB優(yōu)勢菌種。條帶AOB7隨DO濃度降低而逐漸減弱，當DO濃度為1.5mg/L時消失。AOB3在濃度為4.5、3.5、2.5mg/L使出現(xiàn)，而AOB5僅在DO濃度為2.5、3.5mg/L時出現(xiàn)。AOB1僅在DO濃度為0.5mg/L時出現(xiàn)。AOB8在濃度高時條帶較弱，而濃度較低時條帶才變強。

從圖3-6可以得到L1和L2的相似性為1，表明DO濃度為4.5、 3.5mg/L時，AOB群落穩(wěn)定，幾乎沒有任何變化。L1和L2與L3的相似性為0.92， L4與L5的相似性為0.89，可見群落結構相對較穩(wěn)定。從圖3-7，可以看到隨DO濃度降低，AOB菌群香儂多樣性指數(shù)也降低，但不是很明顯。表明AOB菌群沒有出現(xiàn)優(yōu)勢群落明顯減少，可見DO濃度降低對AOB菌群代謝活性影響較小。

(2)DO濃度對Nitrospira群落結構影響

圖3-5、3-8、3-11為不同DO濃度對AOB、Nitrospira、Nitrobacter群落結構影響

DGGE分離結果如圖3-8所示，可得到共有11種菌，條帶標為Np1-Np11。從圖可以看出DO濃度對Nitrospira群落結構影響比較大，且DO濃度較高時，物種相對比較豐富，而隨DO濃度降低，Nitrospira菌群優(yōu)勢群落逐漸變得單一，其中Np5為該菌群優(yōu)勢菌種。DO濃度大于等于2.5mg/L時，Np4、Np7、Np10能夠在系統(tǒng)中保持一定數(shù)量。

從圖3-9可以得到L1-L3泳道和L4-L5泳道的內(nèi)部相似性比較高，但是2組之間確存在較大差別，表明在一定DO濃度范圍內(nèi)Nitrospira群落結構

較穩(wěn)定，但在DO濃度在4.5-2.5mg/L和2.5-0.5mg/L時各DO濃度段優(yōu)勢菌群存在差異較大。相似性最高的是L4與L5，相似性達88.9%，相似性最低的是L4與L3，相似性低至18.2%，說明Nitrospira群落發(fā)生明顯群落交替現(xiàn)象，DO濃度對其影響巨大〔1〕。

圖3-6、3-9、3-12為不同DO濃度條件下AOB、Nitrospira、Nitrobacter菌群DNA相似性樹狀圖

Nitrospira菌群香儂多樣性指數(shù)如圖3-10所示，表明當DO濃度處于

4.5-3.5mg/L時，達到最大值0.8，表明在DO濃度較高情況下，活性

污泥中Nitrospira菌群種類豐富。隨DO濃度降低，香儂多樣性指數(shù)逐

漸減小至0.4左右。說明低DO濃度對Nitrospira菌群有明顯抑制作用。

(3)DO濃度對Nitrobacter群落結構的影響

Nitrobacter群落DGGE分離結果如圖3-11所示，可以得到Nitrobacter

共有9種，條帶標為Nb1-Nb9。還可以看出DO濃度對Nitrobacter群落

圖3-7、3-10、3-13分別為AOB、Nitrospira、Nitrobacter的香儂多樣性指數(shù)

結構具有很大影響。但是優(yōu)勢菌群條帶Nb7、Nb8和Nb9在各種濃度條件下同樣比較穩(wěn)定而且亮度比其他條帶強。DO濃度降低時，Nitrobacter群落結構豐富度也隨之下降。Nb1在DO濃度為2.5mg/L和4.5mg/L時出現(xiàn)，Nb3和Nb5僅在DO濃度為3.5mg/L時出現(xiàn)，Nb4和Nb6僅在DO濃度為4.5mg/L時出現(xiàn)。

圖3-12可以得出，L3-L5泳道相似性高達85%以上，而其與L1和L2相似性卻在70%以下?？梢娫贒O濃度降低的過程中，發(fā)生了明顯的群落交替現(xiàn)象。從圖3-11可以看出，此時除了優(yōu)勢菌群Nb7、Nb8和Nb9外，沒有其他菌種。圖3-13可以看出，DO濃度為0.5mg/L-4.5mg/L范圍內(nèi)，Nitrobacter菌群香儂多樣性指數(shù)范圍為0.6-0.8。可見低DO濃度對Nitrobacter菌群結構也存在抑制作用。且當DO濃度小于2.5mg/L時，Nitrobacter香儂多樣性指數(shù)高于Nitrospira，此時Nitrobacter占NOB主導地位。

4結論

本實驗研究 DO濃度對A-A-O系統(tǒng)硝化功能菌群落多樣性的影響，得出結論：（1）實驗利用PCR—DGGE 技術分析了DO濃度改變的情況下硝化細菌群落結構變化情況，可判別在脫氮過程中起到主要作用的硝化功能菌。（2）DO濃度降低過程中，AOB菌群香儂多樣性指數(shù)降低，但不是很明顯。可見DO濃度降低情況下對AOB菌群代謝活性影響較小。Nitrospira菌群在DO濃度大于等于2.5mg/L時，菌群種類豐富，隨DO濃度降低，香儂多樣性指數(shù)逐漸減小。說明低DO濃度對Nitrospira菌群有明顯抑制作用。當DO濃度低于2.5mg/L時，Nitrobacter細菌香儂多樣性指數(shù)高于Nitrospira，可見此時Nitrobacter菌占NOB主導地位，當DO濃度大于等于2.5mg/L時，兩者香儂多樣性指數(shù)差別不大，一起承擔系統(tǒng)硝化作用。

篇9

關鍵詞 喀斯特；貴州；白三葉；同一花序；形態(tài)多樣性

中圖分類號 S651 文獻標識碼 A 文章編號 1000-2537（2016）05-0038-06

Abstract By observing the shape index of 19 wild Trifolium repens， we compared the morphological diversity of the same inflorescence at different altitudes. Our results imply that the morphological diversity of 19 wild Trifolium repens on the same inflorescence at different altitudes has a markedly difference. The total coefficient variation of all above indices obeys the following order： leaf area>above-ground biomass>stolon length>growing point>height >leaf length>leaf width> growth habit>V shape stripe. Between different altitudes in Trifolium repens form shape in the group have difference degrees of variations. The clustering analysis found little correlation with the altitude origin.

Key words Karst region； Guizhou； Trifolium repens； the same inflorescence； morphological diversity

基因漂移、遺傳漂變、遺傳瓶頸、自然選擇和地方適應性等因素，可以通過在不同時空尺度上的動態(tài)變化來影響并改變生物適應性和多樣化的進程[1].目前，花粉污染、基因漂移等問題已經(jīng)在實驗中得到普遍證實，而大部分研究只是針對一些基礎性工作，如花粉傳播因素、基因漂移距離、雜交親和性等[2-5].空間分離群體之間的隔離和基因流動的程度決定了遺傳差異、生殖隔離和物種形成的潛在能力.遺傳漂變和自然選擇都會使群體之間的差異增加，而基因流的作用會使群體之間的差異減小[5].研究同一花序水平上植物形態(tài)多樣性，可以減少以上因素的影響，使其表型性狀與其生態(tài)適應性的研究更趨于一致.

白三葉（Trifolium repens L.）是多年生草本優(yōu)質牧草，屬異化授粉植物，廣泛分布于世界各地，在農(nóng)牧業(yè)中地位重要.貴州是中國發(fā)育最典型的喀斯特地貌之一，不僅地勢起伏大、切割強、相對高度常達到300～700 m，且喀斯特廣泛發(fā)育，地貌類型較復雜.其次，貴州具有高原峽谷地貌結構特征，導致水土資源分布不平衡，形成了多種特殊的生態(tài)位.白三葉在長期的演化過程中，不斷向著適應其生境的方向進化.本研究收集貴州省境內(nèi)19份白三葉種質為試驗材料，比較其不同海拔高度居群間和同一花序水平上的多樣性，為下一步選育優(yōu)質高效白三葉新品種提供指導.

1 材料和方法

1.1 貴州地理與氣候

試驗在貴州貴陽市貴州牧草推廣站溫室大棚內(nèi)進行，種子收集于貴州省不同海拔區(qū)域.貴州全省大部分地區(qū)氣候溫和，四季分明.全省平均氣溫的最高值出現(xiàn)在7月，平均22～25 ℃；最低值出現(xiàn)在1月，平均為4～6 ℃；年平均氣溫為14～19 ℃.全年極端最高氣溫為34.0～36.0 ℃，極端最低氣溫為-6.0～-9.0 ℃.常年雨量充沛，時空分布不均.全省各地多年平均年降水量大部分地區(qū)為1 100～1 300 mm，最大值接近1 600 mm，最小值約為850 mm.一年中的大多數(shù)雨量集中在夏季.全省大部分地區(qū)年日照1 200～1 600 h，氣候特點是垂直方向差異較大，立體氣候明顯.

1.2 材料收集

2013年5～8月在全省范圍內(nèi)采集野生白三葉種子，有效樣本19份，見表1.

1.3 栽培與觀測

1.3.1 溫室栽培 2014年9月20日在貴州省牧草推廣站溫室大棚播種.從19份材料中各選取一個果實飽滿的花序，將來自同一花序的種子播入有32個小格的育苗培養(yǎng)盤，孔穴大小60 mm×60 mm.每小格播2粒種子，覆土1 cm，澆水.培養(yǎng)基質為m（石英砂）∶m（細土）∶m（腐殖質）=3∶4∶3混合而成，高壓滅菌冷卻后裝盤.待長出小苗后留選長勢較好的一株苗用于觀察研究.

1.3.2 施肥和管理 每隔3個月施復合肥1次，每次施用量0.03 kg/m2，苗期施尿素1次，使用量折合0.012 kg/m2，及時除雜草，適時澆水.

1.3.3 測量指標 2015年5月1日，參照《牧草種質資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標準》[6]及前人研究方法觀測V型斑紋、葉面積、株高、中葉寬、中葉長、匍匐莖長度、生長點個數(shù)及地上生物量等指標.為便于分析，將非量化性狀特征進行標準化賦值.海拔：1=1 000 m以下，2=1 000～1 500 m，3=1 500～2 000 m，4=2 000 m以上；有無V型斑：有斑=1，無斑=2；生長習性：1=直立生長，2=匍匐分枝生長，3=匍匐不分枝生長.

1.4 數(shù)據(jù)分析

用Excel和SPSS 16.0對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計，分析不同海拔高度區(qū)域白三葉種內(nèi)、同一花序水平上各個性狀的差異程度.各形態(tài)變異性以變異系數(shù)CV表示，CV（%）=100×S/M（S為標準差，M為平均值）.用Person相關系數(shù)分析各個性狀之間的相關性，并對各個指標標準化后用算術平均法（UPGMA）聚類分析.

2 結果與分析

2.1 白三葉形態(tài)學分析

2.1.1 同一花序白三葉形態(tài)學性狀差異分析 同一花序水平上和不同種群間白三葉形態(tài)存在較大差異（表2）.總變異系數(shù)大于300%的有7個居群，其中W16總變異系數(shù)最大，高達429.74%，其次是W12，W1，W9，W6，W3，W10；最小的是W7，總變異系數(shù)為236.9%.各指標總變異系數(shù)從大到小為中葉面積、地上生物量、匍匐莖長度、生長點數(shù)、株高、中葉長、中葉寬、生長習性、有無“V”斑.株高變異系數(shù)最大的是W10和W18，分別為37.93%和37.51%，W2最小，只有12.63%.地上生物量變異系數(shù)最大的是W3和W1，分別為98.48%和81.67%，W14和W7的最小，為38.31%和38.55%.匍匐莖長度的變異范圍為30.95%～65.75%，變異系數(shù)最大和最小分別是W7和W3.中葉寬的變異范圍主要為10.89%～32.11%，只有居群W8的變異系數(shù)高達60.61%.中葉長的變異范圍為13.33%～32.77%，變異系數(shù)最大的為W16，最小為W7.中葉面積的總變異系數(shù)比其他指標大，其中W16，W12，W3和W6的變異系數(shù)均大于100%，最小的是W11，只有30.33%.生長習性的變異范圍為0～35.33%，其中W14，W18和W19的變異系數(shù)均為0，即這幾個居群都是匍匐分枝生長.有無“V”形斑中只有W1，W5，W11，W13和W19發(fā)生了變異，其余居群全都有“V”斑.生長點個數(shù)最大變異是W1，為64.09%，其次是W16，W9，W12和W10，最小的是W2，僅為0.75%.

2.1.2 不同海拔高度白三葉形態(tài)學數(shù)量性狀分析 不同海拔區(qū)域白三葉形態(tài)形狀居群間存在顯著差異，見表3.總體上，隨著海拔的提升，白三葉植株越來越高，生長點數(shù)越來越多，地上生物量也越來越大；而匍匐莖長度、中葉寬、中葉長和中葉面積則隨著海拔的提升而增大，高于2 000 m的區(qū)域則有所減小.在低于1 000 m的區(qū)域，匍匐莖長度的變異系數(shù)最大，高達102.87%，其次是地上生物量、中葉面積，最小的是中葉寬，僅為25.49%.在1 000～1 500 m區(qū)域，變異范圍為21.43%～80.46%，最大的為匍匐莖長度，其次是地上生物量、生長點個數(shù)、中葉面積，最小的是中葉寬.在1 500～2 000 m區(qū)域，變異范圍是21.29%～49.62%，其中變異最大的為地上生物量，其次是中葉面積，中葉寬變異最小.在大于2 000 m的區(qū)域，匍匐莖長度的變異系數(shù)最大，為61.37%，其次是地上生物量、中葉面積、株高，最小為中葉長，僅為23.21%.

2.2 形態(tài)學形狀相關性分析

白三葉的株高與地上生物量、匍匐莖長度、中葉寬、中葉長、中葉面積、生長習性及生長點數(shù)呈極顯著相關性（見表4），與有無“V”形斑和海拔高度無顯著相關；地上生物量與匍匐莖長度、中葉寬、中葉長、中葉面積及生長習性呈極顯著相關，與海拔高度呈顯著相關；匍匐莖長度與生長點數(shù)極顯著相關；中葉寬與中葉長、中葉面積、生長習性及生長點數(shù)呈極顯著相關；中葉長與中葉面積、生長點數(shù)及生長習性呈極顯著相關；中葉面積與生長習性及生長點數(shù)極顯著相關；生長習性與生長點數(shù)呈極顯著相關；生長點數(shù)與海拔呈極顯著相關性.即隨海拔的提高，地上生物量也隨之增大，生長習性有由直立生長到匍匐分枝到匍匐不分枝生長的趨勢.

2.3 基于白三葉形態(tài)性狀的聚類分析

根據(jù)貴州野生白三葉的形態(tài)鑒定數(shù)據(jù)進行聚類分析，在歐氏距離為14.5截距處，可將19份白三葉劃分為3個聚類（圖1），3個聚類性狀平均值見表5.第Ⅰ類包括8份材料，平均株高最矮，地上生物量、匍匐莖長度、中葉寬、中葉長、中葉面積和生長點數(shù)的平均值最小，只有少數(shù)無“V”形斑點；第Ⅱ類包括10份材料，其生長點數(shù)最多，其余性狀指標的平均值介于第Ⅰ、Ⅲ類之間，少數(shù)無“V”形斑點，大多是匍匐分枝生長；第Ⅲ類只有材料7（匯川區(qū)董公市鎮(zhèn)，987 m）獨自成一類，除匍匐莖長度最短外，生長點數(shù)介于第Ⅰ、Ⅱ類之間，全部有“V”形斑點，均匍匐分枝生長，其余形狀指標的平均值均大于第Ⅰ、Ⅱ類.由此可知，聚類分組與海拔高度沒有明顯的關系.

3 討論與結論

3.1 巖溶地區(qū)不同海拔野生白三葉同一花序形態(tài)多樣性

種質資源是生物遺傳變異和生物多樣性遺傳的物質基礎，運用形態(tài)學標記研究植物外部形態(tài)，受基因及所處生態(tài)環(huán)境的共同影響.目前，關于開花植物花序內(nèi)變異原因的研究有很多[7]，有研究證明，對不同生態(tài)環(huán)境下的同種植物的形態(tài)學研究，可以了解環(huán)境對基因表達的影響[8]，而不同海拔區(qū)域帶來的環(huán)境差異會使各類昆蟲的活動受到限制或促進，導致不同海拔地區(qū)訪花者種類和訪問比例的差異[9].在同一花序水平上研究不同海拔區(qū)域白三葉表型特征，既可以減少基因漂移、花粉污染等外部影響，還可了解由海拔帶來的環(huán)境差異對其形態(tài)的影響，為下一步研究工作提供更精密的數(shù)據(jù).本研究結果顯示，貴州19份野生白三葉同一花序水平上總變異系數(shù)大于300%的有7個居群，其中W16總變異系數(shù)最大，無論是居群內(nèi)還是居群間貴州白三葉形態(tài)差異都比新疆[10]白三葉的大；各指標中總變異系數(shù)為最大的是中葉面積，其次是地上生物量、匍匐莖長度、生長點數(shù)、株高，說明其可塑性較大.貴州因地勢起伏較大，生境復雜，蘊藏著豐富的野生植物資源，例如鐘理[11]發(fā)現(xiàn)貴州野生匐剪股穎各形態(tài)學性狀均存在較大的變異，形態(tài)遺傳變異多產(chǎn)生于居群內(nèi).本研究材料采集地間海拔跨度較大，小氣候類型多樣，生境差異明顯，為適應不同的生境，白三葉在長期的進化過程中，形態(tài)性狀也隨之改變.

3.2 巖溶地區(qū)同一花序野生白三葉的多樣性與育種

在育種工作中，借助部分表型性狀及其組合，可實現(xiàn)對白三葉目標性狀的有效選擇.本研究中不同海拔區(qū)域甚至同一花序白三葉栽培群體內(nèi)都存在較豐富的遺傳變異，可塑性較大，可為優(yōu)良類型的選擇提供材料.目前，對白三葉形態(tài)農(nóng)藝性狀已有較多研究，但主要集中在居群間和居群內(nèi)水平上[10，12-13]，在花序水平上的研究還未見報道.目前分子生物學技術已成為植物育種研究的有效工具，如李潤芳[14]運用細胞學方法和SRAP分子標記技術對8種三葉草的種質資源遺傳多樣性進行了初步評價，張婧源[15]對來自30個國家的70份野生白三葉從表型性狀、SRAP分子標記和SSR分子標記上進行了不同產(chǎn)地白三葉種質資源遺傳多樣性研究.在花序水平上研究其形態(tài)多樣性，通過人工選育成的優(yōu)良品種經(jīng)濟性狀整齊、遺傳基因穩(wěn)定.因此，對白三葉進行優(yōu)良品種選育，最終建立良種繁育體系成為獲得質量穩(wěn)定、可控優(yōu)質白三葉的必經(jīng)之路.

3.3 巖溶地區(qū)貴州野生白三葉的利用價值和開發(fā)前景

貴州地處我國云貴高原，屬長江、珠江上游地區(qū)，是我國典型喀斯特區(qū)域之一，地理位置特殊，其生態(tài)環(huán)境的優(yōu)劣將直接影響整個長江、珠江流域的生態(tài)環(huán)境安全.目前，對喀斯特地區(qū)生態(tài)系統(tǒng)植物恢復多集中在森林生態(tài)系統(tǒng)的恢復研究[16]，對喀斯特山地草地相關研究還比較少[17].對貴州野生白三葉種質資源進行研究，揭示喀斯特地區(qū)白三葉種質資源豐富度、多樣性、蘊藏量等特征，可為喀斯特石漠化地區(qū)草地植被恢復提供支持.本研究通過統(tǒng)計分析白三葉同一花序水平上形態(tài)多樣性，發(fā)現(xiàn)其可塑性較大，在育種工作中可利用差異較大的材料W16和W12作為親本培育優(yōu)質高效品種.還可利用白三葉進行礦山植被修復，有研究發(fā)現(xiàn)其能同時富集污染土壤中的銅、鎘、鉛，且富集量大[18]，是很好的礦山修復植被之一.此外，白三葉還是重要的優(yōu)質豆科牧草之一，影響當?shù)剞r(nóng)牧業(yè)發(fā)展.因此，下一步將全面系統(tǒng)地調(diào)查和收集貴州、四川、廣西、新疆及云南等地區(qū)野生白三葉種質資源，增加其多樣性，為充分發(fā)揮白三葉資源的生態(tài)和經(jīng)濟效益提供支持.

參考文獻：

[1]韋祖生，田益農(nóng)，馬崇熙. 作物基因漂移研究綜述[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技， 2011（13）：13-15.

[2]牟 彤. 白三葉化學誘變后代遺傳變異的研究[D].哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學， 2013.

[3]何 靜，陳瑞祥，劉秀峰. 俄羅斯白三葉在貴州南部的引種試驗初報[J]. 種子， 2013，32（3）：59-61.

[4]GUSTINE D L， HUFF D R. Genetic variation within and among white clover populations from managed permanent pastures of the Northeastern USA[J]. Crop Sci， 1999，39（2）：524-530.

[5]曲若竹，侯 林，呂紅麗，等. 群體遺傳結構中的基因流[J].遺傳，2004，26（3）：377-382.

[6]李志勇，王宗禮，師文貴，等.牧草種質資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標準[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社， 2005.

[7]謝田朋，杜國禎，張格非，等. 黃帚橐吾種子生產(chǎn)的花序位置效應及其對幼苗建植的影響[J].植物生態(tài)學報， 2010，34（4）：418-426.

[8]苗佳敏，鐘金城，陳智華.披堿草屬種質資源研究現(xiàn)狀[J].草業(yè)與畜牧， 2007，27（11）：2222-2227.

[9]段元文，張挺峰，劉建全.山莨菪（茄科）的傳粉生物學[J].生物多樣性， 2007，15（5）：584-591.

[10]王玉祥，張 博. 新疆野生白三葉表型性狀變異研究[J]. 草地學報， 2012，20（6）：1163-1168.

[11]鐘 理. 貴州野生匍匐剪股穎種質資源遺傳多樣性及越夏生理動態(tài)研究[D].成都：四川農(nóng)業(yè)大學， 2008.

[12]李 州，彭 燕，張婧源，等.白三葉種質資源形態(tài)變異與地理起源的關系[J].草業(yè)科學， 2012，29（11）：1706-1714.

[13]王建麗，申忠寶，潘多鋒，等. 白三葉種質資源主要數(shù)量性狀的變異與相關性研究[J]. 中國農(nóng)學通報， 2012，28（26）：19-23.

[14]李潤芳.三葉草的細胞學、分子標記及多倍體誘導研究[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學， 2007.

[15]張婧源.世界范圍野生白三葉種質資源的遺傳多樣性研究[D].成都：四川農(nóng)業(yè)大學， 2013.

[16]魏 媛，張金池，俞元春，等.貴州高原退化喀斯特森林恢復過程中土壤微生物生物量碳、微生物熵的變化[J]. 農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化研究， 2009，30（4）：487-490.

篇10

關鍵詞：湖泊濕地；濕地保護；濕地修復；研究進展

中圖分類號：S157：TV213.4文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2017）05-0151-08

Research Progress on Protection and Restoration of Urban Wetlands

Yan Xiong，Wei Xianliang，Wei Qianhe，Wang Chen，Peng Errui

（College of Hydraulic Engineering，Yunnan Agricultural University， Kunming 650201，China）

AbstractIn this paper， we analyzed the problems faced by lake wetlands， such as water pollution， area shrinkage， biodiversity loss， serious biological invasion， single research method， ambiguous direction， lagging education， imperfect legal system and management chaos. Start from the functionality of lake wetlands， eight major principles concerning lake wetlands protection and restoration were put forward. In addition， the research progress of wetland restoration both at home and abroad was also summarized from three aspects of physical measures， chemical measures and biological measures. In the end， we raised the overall framework of lake wetlands protection and overall planning， focusing on integration with eco-hydraulics， market operation mechanism and other protective countermeasures. With the purpose to promote the research on lake wetlands， and the overall development of the subject of wetlands protection and restoration， the future was expected from ecology monitoring， system regulation， degradation diagnosis， evaluation mechanism， scientific planning， deepening research， strengthening management and other aspects.

KeywordsLake wetlands； Wetland protection； Wetland restoration； Research progress

《竦毓約》中的濕地定義：“陸地上所有的水體、濕地內(nèi)水深超過6 m的水域和低潮時水深不超過6 m的海濱”[1]。照此定義，濕地應包括湖泊、沼澤、水庫、池塘、水田、蓄滯洪區(qū)、濕草甸、河流河口三角洲以及低潮時水深淺于6 m的海域部位，其中湖泊濕地包括永久性淡水湖、咸水湖、內(nèi)陸鹽湖和季節(jié)性淡水湖、咸水湖[2]。

湖泊濕地作為一種重要的自然資源，發(fā)揮著供水、灌溉、調(diào)洪、養(yǎng)殖、畜牧、航運、旅游、維護生物和遺傳多樣性、降解污染、凈化水質和控制侵蝕等多種功能，在維持區(qū)域生態(tài)平衡和促進區(qū)域社會經(jīng)濟發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[3]。然而近20年來，人們在開發(fā)利用湖泊資源的過程中，忽視了對湖泊的有效保護和管理，致使出現(xiàn)了以下新情況：湖泊濕地的水體污染加劇、富營養(yǎng)化嚴重；生物入侵嚴重、多樣性下降；大規(guī)模圍墾種植、面積萎縮等，這些現(xiàn)象使湖泊濕地生態(tài)系統(tǒng)逐漸喪失其功能，造成了嚴重的環(huán)境問題。因此，采取積極有效的措施，促進湖泊濕地生態(tài)環(huán)境保護與生態(tài)功能恢復，已是當務之急。

從19世紀起國外學者就開始了對湖泊濕地的保護與修復研究工作，而我國在2006年也制定了《全國濕地保護工程規(guī)劃》，明確了濕地保護工作的指導原則、任務目標、建設布局和重點工程，但湖泊濕地的保護和修復工作在上述規(guī)劃中并沒有被突出強調(diào)，也沒有引起相關專家學者的足夠重視。

1湖泊濕地面臨的主要問題

通過歸納前人的一些研究成果，本研究對湖泊濕地生態(tài)系統(tǒng)有了相對比較全面的功能界定，其最主要的功能在于其生態(tài)功能和社會功能（見表1）。

近幾十年來，人們對湖泊濕地功能缺乏了解，保護意識淡薄，在短期利益驅動下，違背自然規(guī)律，不合理開發(fā)，使?jié)竦毓δ苁艿絿乐馗蓴_和破壞。

1.1水質污染，富營養(yǎng)化日趨嚴重

雖然國家對保護環(huán)境逐年重視，環(huán)境治理力度也不斷增加，但是治理速度遠遠跟不上水體污染的步伐。2014年我國污廢水排放總量達716.2億噸[8]，在監(jiān)測的28個重點湖泊中，滿足Ⅱ類水質要求的只有1個，而其中滇池、巢湖和太湖等均處于不同程度富營養(yǎng)化狀態(tài)[9]。陳小鋒等[10]對中國典型湖泊的富營養(yǎng)化情況進行調(diào)研，表明近30年是我國湖泊富營養(yǎng)化的高速發(fā)展階段。

1.2面積萎縮，生態(tài)功能衰退

湖泊濕地面積萎縮，導致濕地生態(tài)系統(tǒng)的調(diào)蓄洪水、水體凈化等各項功能逐漸喪失。近30年來，我國面積大于1.0 km2的新生湖泊有60個，但原面積大于1.0 km2的湖泊卻消失了243個[11]。2000―2010年全國最大面積超過1 000 km2的湖泊共有12個，但其中6個在萎縮，鄱陽湖萎縮速率最快，為54.76 km2/a[12]，其中東北地區(qū)，湖泊面積由12 234.02 km2銳減至11 307.58 km2[13]。

1.3生物多樣性下降，資源銳減

湖泊濕地中水陸交錯的自然生態(tài)系統(tǒng)，是各種動植物的棲息地，然而人類對湖泊濕地的無序開發(fā)，造成生境和物種群落多樣性下降、生物資源退化，尤其是造成珍稀動物資源面臨瀕危和滅絕的危險。例如：1998―2003年期間，洪澤湖底棲生物原有76種，減至50種，魚類減少29種；鳥類原有194種，減至146種，其中Ⅱ類重點保護鳥類減少14種[14]。鄱陽湖由于圍墾和排水開墾等原因，魚類、越冬候鳥等生物的生境大量減少，導致生物多樣性嚴重破壞[15]。

1.4生物入侵嚴重

在湖泊濕地生態(tài)系統(tǒng)中，盲目引進外來物種，致使本地物種瀕危的現(xiàn)象，已成為21世紀全球性環(huán)境問題[16]。例如，在水生生態(tài)系統(tǒng)中，最為突出的入侵物種有鳳眼蓮[17]和水花生[18]，目前它們已經(jīng)對濕地和水生生態(tài)系統(tǒng)造成了極大危害，特別是滇池濕地受鳳眼蓮之害，治理難度大。在陸生生態(tài)系統(tǒng)中，紫莖澤蘭[19]、豚草[20]和大米草[21]的入侵，嚴重影響了當?shù)匚锓N的生長，其中大米草在東南沿海局部地區(qū)對當?shù)厣锒鄻有栽斐善茐?。薇甘菊[22]在浙江、廣東大面積入侵農(nóng)田，暴發(fā)成災。另一方面，引進外來魚類對土著魚類也造成危害[23]。綜上所述，隨意引入外來物種，其后果在短期內(nèi)是不可預見的。

1.5研究手段較單一，研究方向不清晰

目前大部分濕地恢復研究主要圍繞局部濕地格局恢復和調(diào)整的模式，缺乏對流域尺度格局與水生態(tài)過程的系統(tǒng)研究[24]，很難建立對濕地進行整體性水生態(tài)過程恢復和調(diào)控的機制。另一方面，N、P和COD主要源于生活污水、工業(yè)廢水、農(nóng)田施肥和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)及畜牧業(yè)等[25，26]；而在沒有做到控源截污的前提下，只是片面強調(diào)通過采用生態(tài)恢復措施來凈化湖泊濕地水環(huán)境[27]，竟然一度成為湖泊富營養(yǎng)化治理的主流方向。

1.6宣傳教育滯后，法制體系不完善，管理混亂

目前我國濕地合理利用與保護的宣傳、教育工作嚴重滯后于現(xiàn)階段資源保護形勢和經(jīng)濟發(fā)展的要求，且其強度和輻射范圍均不夠，人們對濕地的保護意識和對濕地價值的全面認識尚有所欠缺[28]。此外，目前我國沒有專門針對湖泊濕地規(guī)范利用與保護的法律、法規(guī)。已有的相關法律、法規(guī)中有關湖泊濕地規(guī)范利用和保護的條款較為分散、不成體系、不夠全面，并且各法條間相互交叉、重復的情況并存，很難發(fā)揮其實質效能[29]。最后，湖泊濕地開發(fā)利用及保護管理牽涉面廣、涉及部門多，尚未完全形成良好的內(nèi)部協(xié)調(diào)機制，且管理手段和方法滯后[30]。

2湖泊濕地保護與修復的研究進展

2.1濕地修復原則

①生態(tài)效益與經(jīng)濟效益相統(tǒng)一原則。即湖泊濕地的效益是綜合性的[31，32]。目前國外的生態(tài)功能―經(jīng)濟效益綜合評價缺乏定量方法，采取描述或D形表示兩種形式，我國董哲仁等[33]提出經(jīng)濟效益和生態(tài)功能綜合評價矩陣方法，建立了一種數(shù)學表達方法，實現(xiàn)湖泊濕地功能和效益綜合評價的定量化；②風險最小和效益最優(yōu)原則[34]。在湖泊濕地修復規(guī)劃中權衡方案，對被恢復湖泊濕地進行全面的綜合分析、論證，在考慮生態(tài)、經(jīng)濟、社會效益最大化的同時，兼顧風險和投資；③整體性原則。湖泊濕地恢復不僅應促進退化濕地構成要素的原位恢復，還應重視恢復濕地所處集水區(qū)域內(nèi)的橫向水文聯(lián)系、與所處流域上下游之間的縱向水文聯(lián)系以及地下水和地表水系統(tǒng)的垂直方向的水文聯(lián)系；④地域性原則。制定湖泊濕地修復計劃前，應全面掌握濕地類型、氣候條件、地理條件、經(jīng)濟基礎等修復區(qū)的相關信息。充分分析修復計劃對湖泊區(qū)域經(jīng)濟和生態(tài)價值的影響，突出地域性特征，最大可能維持地帶性植被，減少對當?shù)厣锶郝涞钠茐?；還需尊重當?shù)貍鹘y(tǒng)鄉(xiāng)土文明，保護自然生態(tài)環(huán)境的成分，維持地域性的生態(tài)平衡[35]；⑤穩(wěn)定性原則。保護和修復湖泊濕地應重視系統(tǒng)內(nèi)部各組成要素之間和系統(tǒng)環(huán)境之間的協(xié)調(diào)及統(tǒng)一程度、生物群落的組成、群落功能和結構的完整；⑥可行性原則。在湖泊濕地保護與恢復工程實施前，應考慮項目的環(huán)境可行性和經(jīng)濟可行性；⑦優(yōu)先性和稀缺性原則。湖泊濕地保護與修復項目需突出針對性，應優(yōu)先保護瀕臨滅絕物種的生物棲息和地稀缺濕地[36]；⑧景觀和美學原則。李春暉等[37]人將水質、生態(tài)和景觀定為濕地修復的三大目標，闡明恢復濕地景觀和添增美學效果的重要性。

2.2修復技術與進展

總結國內(nèi)外湖泊濕地修復的研究成果，湖泊濕地修復技術可分為物理措施、化學措施和生物措施三大類共13種（見表2），且這些技術已在國內(nèi)外湖泊濕地修復工程中得到廣泛應用。

2.2.1物理措施劉華麗等[38]分別從外源污染、沉水植物、作業(yè)區(qū)域和深度3個方面，研究了對沉積物疏浚技術效果的關鍵影響因素；張杰等[39]基于DEM和土地利用土地覆蓋的適宜性分析為濕地恢復提供了理論依據(jù)；張修峰等[40]通過使用STELLA軟件，構建了三濕地水體TP變化生態(tài)模型并成功的進行了模擬研究，結果表明對底泥不同程度的疏浚，會影響對水質改善效果；萬玉文[41]通過采用柱形管槽靜態(tài)的模擬塘堰濕地，模擬了不同水深處理下的底泥氮磷釋放對上覆水水質的影響，結果表明水流的擾動會導致底泥中磷的釋放加速；夏紅霞等[42]利用頁巖空心磚構建自動增氧型濕地系統(tǒng)，增強了系統(tǒng)內(nèi)部供氧能力和濕地系統(tǒng)的除氮能力；潘繼征等[43]研發(fā)了人工增氧復合型濕地工藝，其對不同水力負荷和污染負荷都展現(xiàn)出了較強的緩沖調(diào)節(jié)能力和很高的凈化效果 ；黃等[44]利用遙感技術對濕地恢復及生態(tài)調(diào)水進行實時動態(tài)監(jiān)測，及時掌握宏觀地表下的快速變化，也為長期的區(qū)域生態(tài)效應評價提供技術支持；董張玉等[45]結合GIS/RS，對濕地恢復潛力從地貌條件、河流及道路密度、景觀結構因子、濕度指數(shù)、耕地生產(chǎn)力五方面進行空間分析，明確了東北地區(qū)濕地修復的優(yōu)先、次優(yōu)先區(qū)域，并利用景觀指數(shù)、作物生產(chǎn)與濕地協(xié)調(diào)發(fā)展指數(shù)驗證恢復效果。國外學者也做了相關研究，Kowalski等[46]通過采用便攜式圍堰技術，恢復了伊利湖湖濱濕地挺水植被；Tian等[47]在密西西比―俄亥俄―密蘇里河盆地進行濕地水文恢復，其中的“牛軛”設計，有效降低了水體中可溶性活性磷、硝態(tài)氮、總磷和總氮的含量；Zedler[48]對有關濕地恢復理論做了全面的總結，認為濕地恢復應遵循生態(tài)位理論、島嶼生物地理學理論、種群理論和營養(yǎng)級理論；Malson等[49]通過田間和溫室試驗，利用苔蘚配子體片段進行濕地恢復。

2.2.2化學措施黃潔慧等[50]提出采用“徑流雨水匯集、滲流、預處理+河水造流生化預處理+主湖造流生化+構建全湖生物多樣性”的全生態(tài)組合技術，應用于湖泊中；鄭駿宇等[51]采用化學強化―復合人工濕地組合工藝，對濕地的大量顆粒懸浮物和水體中的COD、BOD5和TP的去除效果明顯；徐軼等[52]針對海新河污染特點，采用絮凝沉淀結合人工濕地技術進行修復，效果良好；張帥等[53]探討了生物水處理系統(tǒng)和加載絮凝沉淀技術相結合的研究方法；李曉威等[54]通過試驗確定了最佳絮凝效果時間，并且推算出絮凝劑與泥漿絕對濃度的函數(shù)關系，以及泥漿與絮凝劑的最佳配比。按照得出的函數(shù)關系配比絮凝劑，可以縮短絮凝時間，提高脫水和施工效率。李星等[55]通過研究復合除藻劑，表明了其對藻類具有很好的去除效果；劉愛民等[56]研究了鏈霉菌WH63的抑藻效應，效果明顯；周全等[57]研究了藻存量削減和磷營養(yǎng)控制兩種方法，均能在水華形成的早期對小型富營養(yǎng)化水體藍藻水華起到阻遏作用；李靜會等[58]通過進行化學除藻劑治理藍藻水華的試驗研究，結果表明，除藻劑除抑藍藻效果顯著；王正興等[59]利用國外新型除藻劑―去藻247，研究滇池水藻類污染的治理，并通過線性回歸方程來擬合水體中葉綠素a和總磷的相關性。

2.2.3生物措施吳國旭等[60]研究表明，生物接觸氧化工藝可以實現(xiàn)降解有機物，并利用類似曝氣池的曝氣方法提供氧氣，同時起到混合攪拌的效果；李少華等[61]采用調(diào)水補水、生物調(diào)控等技術對滄州濕地水環(huán)境修復；李靜[62]提出水解酸化―人工濕地處理技術；馬秋莎等[63]通過利用長鏈烷烴的微生物降解作用，對濕地進行研究；鄧志強等[64]通過植物刈割、水生動物強化法、優(yōu)勢植物篩選、微生物強化技術等途徑，解決了人工浮床技術凈化能力差和適用范圍有限的缺陷；朱鳴鶴等[65]通過研究潮灘植物中翅堿蓬對重金屬累計效應，發(fā)現(xiàn)銅、鋅、鉛、鎘4種重金屬在不同潮灘中均有明顯的累計效應；王曙光等[66]用真菌生產(chǎn)生物菌肥，不僅能增加農(nóng)作物產(chǎn)量，還減少了面源污染對濕地水體的污染；吳迪等[67]在上海青浦大蓮湖濕地修復示范工程中，采用改變土地利用模式、水系改造和植被配置等技術，使?jié)竦厣辰Y構和生物多樣性組成都分得到改善；張明祥等[68]根據(jù)研究區(qū)的水文條件、土地利用現(xiàn)狀、海拔和受威脅程度的不同，通過研究結果可知在黃河鄭州段的二灘、嫩灘和部分老灘區(qū)域均可以采用溪流型、蓄水型、多塘型濕地恢復模式；董凱凱等[69]在黃河三角洲蘆葦濕地，通過比較退化區(qū)與淡水恢復區(qū)的土壤pH值、鹽分、全氮、銨態(tài)氮、硝態(tài)氮、有機碳的含量變化，闡明了濕地恢復對土壤碳氮含量的影響；王國棟等[70]采用溫室萌發(fā)法，對天然濕地、不同開墾年限濕地種子庫的規(guī)模和結構進行了研究，詳細地闡述了濕地種子庫的特征及其在植被恢復中的潛力；中國科學院通過研究固定化增殖氮循環(huán)細菌群SBR法，對富營養(yǎng)化湖泊進行水質凈化，實現(xiàn)總氮量和COD下降了75%，氨氮量下降了91.5%[71]。黃磊等[72]研究了空心菜和菖蒲等植物在凈化微污染潛流人工濕地中對N、P的不同去除效果；Tuncsiper[73]對水平潛流式、自由水表流式、表面流式的人工濕地進行研究，發(fā)現(xiàn)此三種形式的濕地系統(tǒng)對NH4+-N的平均去除率為49%～52%，其中表面流式濕地系統(tǒng)的平均去除率為58%，水平潛流式人工濕地對TP的平均去除率為60%，效果明顯。

2.3湖泊濕地保護對策研究

2.3.1制定湖泊濕地保護總體框架，明確功能定位，分類型、分層次保護根據(jù)湖泊濕地所處范圍內(nèi)的自然環(huán)境特點和社會經(jīng)濟層次，制定湖泊濕地保護目標和總體框架，確定不同區(qū)域、類型湖泊濕地保護的路徑和側重點；在此基礎上，明確湖泊濕地的功能定位及其保護對象、目標和范圍，繼而整治與其功能定位不相符且不合理的開發(fā)行為，逐步恢復其被破壞功能，保證其生態(tài)功能的完整性和系統(tǒng)健康；劃分重要開發(fā)利用區(qū)、緩沖區(qū)、保護區(qū)等，分層次進行有效保護，從而引導和規(guī)范湖泊濕地資源的可持續(xù)利用，并且維護和提升湖泊濕地的主導功能。

2.3.2從流域整體性角度，進行全面濕地修復規(guī)劃湖泊往往與池塘、渠道、河流等部分組成復雜的濕地水生態(tài)系統(tǒng)，各部分間互相影響，相互制約[88]。因此，對湖泊濕地修復規(guī)劃，應從流域的層面上進行整體性考量[3，89]。近10年來，國際上學者突出濕地生態(tài)系統(tǒng)整體恢復和調(diào)控思想，從大尺度上考慮毗鄰集水區(qū)域和湖泊濕地所處整個流域的生態(tài)系統(tǒng)結構和功能完整性[90]。長江中游的“重建江湖聯(lián)系，恢復濕地生命網(wǎng)絡” 和鄱陽湖的“山江湖”等示范項目，即是在流域尺度上的濕地保護與修復的研究[91]；“萊茵河行動計劃”濕地修復項目就是以流域尺度為出發(fā)點，進行水生態(tài)過程和水環(huán)境修復，取得顯著效果[92]。Hermoso等[93]研究表明濕地恢復過程中，地下水深度變化對土壤和植被類型影響很大，濕地恢復除應強調(diào)流域之間連接性的修復外，還應考慮到地下水與地表水之間的水文聯(lián)系。

2.3.3湖泊濕地修護側重與生態(tài)水工結合20世紀90年代開始，美國在南佛羅里達大沼澤區(qū)域的濕地恢復項目，應用生態(tài)水工學，將人工直線型重新恢復曲線型河道，減緩了區(qū)域內(nèi)雨季水體的排泄速率，實現(xiàn)了大沼澤竦厴態(tài)需水補給[94]。日韓等國提出“與自然親近工程”的修復理念，如采用新型生態(tài)材料建造人工島，為動物提供棲息地[95]。在湖泊濕地修復工程中，結合生態(tài)水工學原理，在一定程度上保持其原有自然生態(tài)水文過程，在滿足安全的條件下，改善濕地的生態(tài)功能，采用有益于濕地生態(tài)系統(tǒng)及生物多樣性保護的施工規(guī)范和標準，作為湖泊濕地修復重要思路之一[96]。

2.3.4完善湖泊濕地修復市場運作機制美國20世紀90年代基于“無凈損失”濕地恢復與保護政策發(fā)展了“濕地銀行”等濕地恢復市場機制[97]?！皾竦劂y行”商業(yè)化的市場運作模式，使土地開發(fā)與濕地保護形成一種良性互動；美國密西西比河流域濕地恢復提出一種“氮農(nóng)業(yè)”的運作模式，鼓勵農(nóng)民恢復建立濕地以降低輸入海灣的氮負荷，其中政府向個人提供補貼，用于恢復可儲蓄洪水的濕地，且建立了“氮農(nóng)業(yè)”交易市場，促進各方參與交易，最后評估得到去除1噸氮的濕地相當于2 500美元的補貼價值[90]。該市場機制在減輕農(nóng)業(yè)從業(yè)者對政府補助依賴的同時，還減少了這些區(qū)域的農(nóng)業(yè)非點源污染，及增強了防洪安全。

3研究展望

3.1加強湖泊濕地生態(tài)系統(tǒng)監(jiān)測與調(diào)控

結合3S技術，收集其生態(tài)特征的變化指標，建立信息數(shù)據(jù)庫，及時動態(tài)掌握其環(huán)境狀況，針對性的采取科學的保護與修復措施，實施調(diào)控。

3.2建立湖泊濕地退化診斷與評價機制

研究湖泊濕地結構和功能的退化過程，探求其驅動因子和關鍵過程，辨析湖泊濕地退化機制和模式。將實體模型與數(shù)值模擬相結合，剖析水循環(huán)過程對濕地演變的作用機制，模擬湖泊濕地生態(tài)系統(tǒng)的結構、特征、規(guī)模對人類活動的響應，建立湖泊濕地評價機制。

3.3科學規(guī)劃，恢復河湖連通性

基于河湖水系在水文和水環(huán)境等方面的復雜性，目前對河湖水系連通及其區(qū)域系統(tǒng)間相互影響還缺乏充分認識，迫切需要針對自然因素和人類活動因素造成的連通性削弱或中斷問題以及河湖水系間連通性方面的戰(zhàn)略需求，開展河湖水系間生態(tài)連通規(guī)劃關鍵技術研究，在基礎理論、工程體系、仿真平臺及效果評估等方面創(chuàng)新研究，構建河湖濕地水系間生B連通規(guī)劃技術體系。

3.4建立湖泊濕地生態(tài)經(jīng)濟的可持續(xù)管理模式

可持續(xù)管理模式具體措施如下：加強濕地旅游管理；加大宣傳教育力度，普及濕地及其保護的知識、法律法規(guī)，強化民眾的濕地生態(tài)憂患和保護意識；進行濕地立法，及完善地方法律法規(guī)，使?jié)竦乇Ｗo或開發(fā)利用進入有序和法制狀態(tài)；制定湖泊濕地經(jīng)濟發(fā)展規(guī)劃時，突出生態(tài)經(jīng)濟可持續(xù)發(fā)展。

3.5加強國際交流與合作，深化濕地科學研究

加強濕地的基礎和應用技術研究，及時掌握國內(nèi)外濕地修復學術動態(tài)，總結并推廣開發(fā)利用及保護的成功經(jīng)驗；擴大合作領域，建立國際交流機制，開展多課題、多學科綜合研究。

參考文獻：

[1]姜文來，袁軍.濕地[M].北京：氣象出版社，2004.

[2]李玉鳳，劉紅玉.濕地分類和濕地景觀分類研究進展[J].濕地科學，2014，12（1）：102-108.

[3]戴小琳，傅鐵.湖泊濕地修復工程應注意的問題及對策措施[J].人民長江，2011，42（15）：69-72.

[4]曹新向，翟秋敏，郭志永.城市濕地生態(tài)系統(tǒng)服務功能及其保護[J].水土保持研究，2005，12（1）：145-148.

[5]Solomon S，Qin D，Manning M，et al.Climate change 2007：the physical science basis.contribution of working group Ⅰ to the fourth assessment report of the intergovernmental panel on climate change[M].Cambridge，United Kingdom and New York，USA：Cambridge University Press，2008.

[6]徐迎.城市濕地對城市人居環(huán)境可持續(xù)發(fā)展影響機制初探[J].資源環(huán)境與發(fā)展，2007（2）：84-86.

[7]趙生才.中國濕地退化、保護與恢復――香山科學會議第241次學術討論會[J].地球科學進展，2005，20（6）：701-704.

[8]佚名.全國環(huán)境統(tǒng)計公報[M].北京：中華人民共和國環(huán)境保護部，2014.

[9]高俊峰.中國五大淡水湖保護與發(fā)展[M].北京：科學出版社，2012.

[10]陳小鋒，揣小明，楊柳燕.中國典型湖區(qū)湖泊富營養(yǎng)化現(xiàn)狀、歷史演變趨勢及成因分析[J].生態(tài)與農(nóng)村環(huán)境學報，2014，30（4）：438-443.

[11]馬榮華，楊桂山，段洪濤，等.中國湖泊的數(shù)量、面積與空間分布[J].中國科學：地球科學，2011，41（3）：394-401.

[12]孫芳蒂，趙圓圓，宮鵬，等.動態(tài)地表覆蓋類型遙感監(jiān)測：中國主要湖泊面積2000～2010年間逐旬時間尺度消長[J].科學通報，2014，59（4/5）：397-411.

[13]李寧，劉吉平，王宗明.2000―2010年東北地區(qū)湖泊動態(tài)變化及驅動力分析[J].湖泊科學，2014，26（4）：545-551.

[14]葛緒廣，王國祥. 洪澤湖面臨的生態(tài)環(huán)境問題及其成因[J].人民長江，2008，39（1）：28-30.

[15]Zhao S Q，F(xiàn)ang J Y，Miao S L.et al.The 7-decade degradation of a large freshwater lake in Central Yangtze River，China[J].Environmental Science & Technology，2005，39：431-436.

[16]鞠瑞亭，李慧，石正人，等.近十年中國生物入侵研究進展[J].生物多樣性，2012，20（5）：581-611.

[17]王智，張志勇，張君倩，等.水葫蘆修復富營養(yǎng)化湖泊水體區(qū)域內(nèi)外底棲動物群落特征[J].中國環(huán)境科學，2012，32（1）：142-149.

[18]戴紅君.入侵雜草水花生對本地昆蟲蝦鉗菜披龜甲的影響研究[D].揚州：揚州大學，2009.

[19]雷桂生，王五云，蔣智林，等. 紫莖澤蘭與伴生植物小藜的競爭效應及其生理生化特征[J].生態(tài)環(huán)境學報，2014，23（1）：16-21.

[20]謝俊芳，全國明，章家恩，等.豚草入侵對中小型土壤動物群落結構特征的影響[J].生態(tài)學報，2011，31（19）：5682-5690.

[21]朱士文，潘秀蓮，李秀啟，等.外來物種米草對黃河三角洲生態(tài)環(huán)境的影響[J].山東農(nóng)業(yè)科學，2012，44（3）：73-75，83.

[22]邱_，楊志高，陳偉，等.廣州薇甘菊潛在空間分布預測分析[J].中南林業(yè)科技大學學報，2010，30（5）：128-133.

[23]巴家文，陳大慶.三峽庫區(qū)的入侵魚類及庫區(qū)蓄水對外來魚類入侵的影響初探[J].湖泊科學，2012，24（2）：185-189.

[24]劉吉平，呂憲國，崔煒煒.別拉洪河流域濕地變化的多尺度空間自相關分析[J].水科學進展，2010，21（3）：392-398.

[25]Wayland K，Long D，Hyndman D，et al. Identifying relationships between base flow geochemistry and land use with synoptic sampling and R-Mode factor analysis[J].J. Environ. Qual.，2003，32：180-190.

[26]Papatheodoroua G，Demopouloua G，Lambrakisb N.A long-tem study of temporal hydrochemical data in a shallow lake using multivariate statistical techniques[J].Ecological Modelling，2006，193：759-776.

[27]張志斌.滇池水污染治理的分析及思考[J].環(huán)境工程，2014，12：26-29，35.

[28]李靜.中國濕地保護立法研究：以生態(tài)系統(tǒng)管理為視角[D].青島：中國海洋大學，2008.

[29]張涵穎.我國濕地法律保護研究[D].北京：中央民族大學，2015.

[30]張春玲，沈大軍.我國現(xiàn)行湖泊管理制度分析[C]//中國水利學會2013學術年會論文集――S2湖泊治理開發(fā)與保護，中國水利學會， 2013.

[31]歐維新，葉麗芳，孫小祥，等.濕地功能評價的尺度效應――以鹽城濱海濕地為例[J].生態(tài)學報，2011，31（12）：3270-3276.

[32]Ghermandi A，van den Bergh J C J M，Brander L M，et al.Values of natural and human-made wetlands： A meta-analysis[J].Water Resoure Res.，2010，46：W12516，doi：10.1029/2010WR009071.

[33]董哲仁，孫東亞.生態(tài)水利工程原理與技術[M].北京：中國水利水電出版社，2007：178.

[34]陳洪全，張華兵.江蘇鹽城沿海灘涂濕地生態(tài)修復研究[J].海洋湖沼通報，2016（4）：43-49.

[35]劉芳宏.城市湖泊型濕地公園規(guī)劃研究[D].哈爾濱：東北林業(yè)大學，2010.

[36]劉志偉.基于InVEST的濕地景觀格局變化生態(tài)響應分析[D].杭州：浙江大學，2014.

[37]李春暉，鄭小康，牛少鳳，等.城市濕地保護與修復研究進展[J].地理科學進展，2009，28（2）：271-279.

[38]劉華麗，曹秀云，宋春雷，等.沉積物疏浚技術在富營養(yǎng)化湖泊修復中的應用[J].環(huán)境污染與防治，2012，34（2）：87-91，101.

[39]張杰，趙振坤，李曉文.濕地恢復與生境改造的規(guī)劃設計――以武漢市郊漲渡湖為例[J].資源科學，2005，27（4）：133-139.

[40]張修峰，陸健健.溫州三濕地底泥疏浚對水體總磷濃度影響的生態(tài)模型研究[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學學報，2006，25（Z1）：158-162.

[41]萬玉文. 基于氮磷釋放的水稻灌區(qū)塘堰濕地底泥凈化能力分析[J].南方農(nóng)業(yè)學報，2012，43（6）：797-801.

[42]夏紅霞，朱啟紅，徐墁澤，等.自動增氧型人工濕地除氮效果研究[J].水生態(tài)學雜志，2014，35（2）：20-24.

[43]潘繼征，李文朝，李海英，等.人工增氧型復合濕地污染物凈化效果[J].生態(tài)與農(nóng)村環(huán)境學報，2010，26（5）：482-486.

[44]黃，劉高煥，傅新，等.黃河三角洲刁口河流路濕地恢復遙感監(jiān)測與評價[J].地理科學進展，2012，31（5）：570-576.

[45]董張玉，劉殿偉，王宗明，等.基于空間分析的東北地區(qū)濕地優(yōu)先恢復[J].應用生態(tài)學報，2013，24（1）：170-176.

[46]Kowalski K P，Wilcox D A，Wiley M J.Stimulating a Great Lakes coastal wetland seed bank using portable cofferdams：implications for habitat rehabilitation[J].Journal of Great Lakes Research， 2009，35（2）：206-214.

[47]Tian K，Chen B K，Bei R T，et al.Application of in-situ technique to study N fluxes on degradaded soils[J].Acta Ecologica Sinica，2003，23（9）：1937-1943.

[48]Zedler J B.Progress in wetland restoration ecology[J].Trends in Ecology and Evolution，2000，15（10）：402-407.

[49]Malson K，Rydin H.The regeneration capabilities of bryophytes for rich fen restoration[J].Biological Conservation，2007，135（3）：435-442.

[50]黃潔慧，周保昌，梅凱.采用生化組合技術有效防治人工湖富營養(yǎng)化[J].中國給水排水，2015（22）：101-104.

[51]鄭駿宇，樓倩，鄭離妮，等.化學強化―復合人工濕地組合工藝對東莞運河污水的處理效果[J]. 環(huán)境工程學報，2016，10（5）：2344-2348.

[52]徐軼，來永斌，賈軼然，等.絮凝沉淀和人工濕地技術在河流污染治理中的應用[J].環(huán)境科學與管理，2008，33（6）：106-109.

[53]張帥，李軍，陳瑜.加載絮凝沉淀工藝在水處理中的應用[J].給水排水，2009，35（S1）：274-278.

[54]李曉威，呂鵬，彭萬里.湖泊環(huán)保疏浚工程中泥漿絮凝效率的優(yōu)化研究[J].人民黃河，2016，38（9）：64-67.

[55]李星，w亮，楊艷玲，等. 復合除藻劑滅藻效能及其機理[J].北京工業(yè)大學學報，2010，36（10）：1402-1407.

[56]劉愛民，閃雅婷，盧存龍，等. 鏈霉菌WH63的抑藻效應[J].環(huán)境工程學報，2016，10（7）：1-6.

[57]周全，侯杰，沈偉，等.磷營養(yǎng)控制與藻存量削減對藍藻水華的阻遏[J].環(huán)境科學與技術，2013，36（11）：54-60.

[58]李靜會，高偉，張衡，等.除藻劑應急治理玄武湖藍藻水華實驗研究[J].環(huán)境污染與防治，2007，29（1）：60-62.

[59]王正興，胡開林，馬玉潔.國外新型藥劑應用于滇池藻類污染治理的研究[J].環(huán)境科學與管理，2009，34（3）：126-128.

[60]吳國旭，楊永杰，王旭.生物接觸氧化法及其變形工藝[J].工業(yè)水處理，2009，29（6）：9-11.

[61]李少華，李巖，李少貞，等.水環(huán)境修復技術在滄州濕地的應用[J].水資源保護，2012，28（4）：91-94.

[62]李靜.重污染河道水解酸化―人工濕地修復工藝技術[J].沈陽建筑大學學報（自然科學版），2015，31（6）：1129-1135.

[63]馬秋莎，劉碩，王繼富，等.石油污染濕地中長鏈烷烴的微生物降解研究進展[J].濕地科學，2014，12（2）：243-250.

[64]鄧志強，閻百興，李旭輝，祝等.人工浮床技術開發(fā)與應用研究進展[J].環(huán)境污染與防治，2013，35（5）：88-92.

[65]朱鳴鶴，丁永生，鄭道昌，等.潮灘植物翅堿蓬對Cu、Zn、Pb和Cd累積及其重金屬耐性[J].海洋環(huán)境科學，2005，24（2）：13-16.

[66]王曙光，刁曉君，馮兆忠.濕地植物的叢枝菌根（AM）[J].生態(tài)學報，2008，28（10）：5075-5083.

[67]吳迪，岳峰，羅祖奎，等.上海大蓮湖湖濱帶濕地的生態(tài)修復[J].生態(tài)學報，2011，31（11）：2999-3008.

[68]張明祥，張陽武，朱文星，等.河南省鄭州黃河自然保護區(qū)濕地恢復模式研究[J].濕地科學，2010，8（1）：67-73.

[69]董凱凱，王惠，楊麗原，等.人工恢復黃河三角洲濕地土壤碳氮含量變化特征[J].生態(tài)學報，2011，31（16）：4778-4782.

[70]王國棟，Middleton B A，呂憲國，等.農(nóng)田開墾對三江平原濕地土壤種子庫影響及濕地恢復潛力[J].生態(tài)學報，2013，33（1）：205-213.

[71]金相燦，劉樹坤，等.中國湖泊環(huán)境：第一冊[M].北京：中國環(huán)境科學出版社，1995： 227.

[72]黃磊，張紹博，魯言言，等.菖蒲和空心菜在處理微污染河水潛流人工濕地中的應用[J].環(huán)境工程學報，2014，8（5）：1845-1850.

[73]Tuncsiper B. Removal of nutrient and bacteria in pilot-scale constructed wetlands[J]. Journal of Environmental Science and Health，2007，42（8）：1117-1124.

[74]張緒良，肖滋民，徐宗軍，等.黃河三角洲濱海濕地的生物多樣性特征及保護對策[J].濕地科學，2011，9（2）：125-131.

[75]崔天翔，宮兆寧，趙文吉，等.不同端元模型下濕地植被覆蓋度的提取方法――以北京市野鴨湖濕地自然保護區(qū)為例[J].生態(tài)學報，2013，33（4）：1160-1171.

[76]王瑋，丁怡，王宇暉，等.人工濕地增氧技術在污水脫氮中的應用[J].工業(yè)水處理，2014，34（8）：1-5.

[77]梁斌，王超，王沛芳.“引江濟太”工程背景下河網(wǎng)稀釋凈污需水計算及其應用[J].河海大學學報（自然科學版），2004，32（1）：32-37.

[78]胡小貞，金相燦，盧少勇，等.湖泊底泥污染控制技術及其適用性探討[J].中國工程科學，2009，11（9）：28-33.