導(dǎo)語(yǔ)：如何才能寫好一篇蛋白質(zhì)組學(xué)，這就需要搜集整理更多的資料和文獻(xiàn)，歡迎閱讀由公務(wù)員之家整理的十篇范文，供你借鑒。

篇1

在疾病基因組的研究中,為了尋找差異表達(dá)的疾病相關(guān)基因或蛋白質(zhì),除了采用傳統(tǒng)的分子生物學(xué)方法,如差減雜交[1]、抑制性差減雜交[2]、差異顯示PCR法[3]及基因表達(dá)串聯(lián)分析技術(shù)(serialanalysisofgeneexpression,SAGE)[4]外,還可采用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法,即從蛋白質(zhì)入手尋找新的或疾病相關(guān)基因或蛋白質(zhì)?；蚝偷鞍踪|(zhì)間并沒(méi)有一一對(duì)應(yīng)的關(guān)系,有mRNA,不一定能表達(dá)為有功能的蛋白質(zhì)。但是,基因要表現(xiàn)其功能,一定要通過(guò)相應(yīng)的蛋白質(zhì)。所以,研究基因,特別是疾病相關(guān)基因,可從研究其表達(dá)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)或功能入手。常見(jiàn)的幾種研究差異表達(dá)蛋白的蛋白質(zhì)組學(xué)方法包括蛋白芯片技術(shù)、雙向電泳技術(shù)、多維液相色譜技術(shù)以及它們和質(zhì)譜鑒定的有機(jī)結(jié)合。

1•1蛋白質(zhì)芯片技術(shù)

繼基因芯片以后,蛋白質(zhì)芯片技術(shù)逐漸發(fā)展起來(lái)。基因芯片又叫DNA芯片,是以DN段為材料的,而蛋白質(zhì)芯片以蛋白質(zhì)或多肽為材料。利用蛋白芯片技術(shù)能同時(shí)從微量的樣品中檢測(cè)成千上萬(wàn)個(gè)蛋白質(zhì)或多肽,用于分析差異表達(dá)的蛋白質(zhì)及藥物靶標(biāo)的鑒定,所以,蛋白質(zhì)芯片在藥物基因組學(xué)的研究中發(fā)揮著極為重要的作用。眾所周知,蛋白質(zhì)不如核酸穩(wěn)定,在蛋白質(zhì)樣品的處理中將會(huì)遇到很多困難,對(duì)蛋白質(zhì)芯片的操作將比對(duì)基因芯片的操作要求更為嚴(yán)格。從基因組測(cè)序知道,僅有約30000~35000個(gè)基因維持人體正常的生理作用[5],由于RNA編輯及翻譯后修飾等因素,使得人體細(xì)胞的總蛋白質(zhì)數(shù)目(蛋白質(zhì)組)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)有活性的基因數(shù)目。因此,能同時(shí)檢測(cè)成千上萬(wàn)蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)芯片技術(shù),是唯一可用來(lái)有效研究人體蛋白質(zhì)組的方法。目前,主要將蛋白芯片和表面增強(qiáng)的激光解吸離子化質(zhì)譜技術(shù)(SELDI-MS)相結(jié)合尋找差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。其原理是將不同生理狀態(tài)的樣品(培養(yǎng)的細(xì)胞或組織樣品)和同一蛋白芯片結(jié)合,洗去未結(jié)合的蛋白質(zhì),然后用SELDI-MS分析結(jié)合的蛋白質(zhì)。一般來(lái)說(shuō),每種芯片可特異地結(jié)合某一細(xì)胞特定的蛋白質(zhì)。具體的操作方法隨不同廠家生產(chǎn)的蛋白芯片不同而異。LiX及其同事[6]將小鼠MRL的耳朵穿刺,觀察耳朵上傷口愈合過(guò)程中蛋白質(zhì)表達(dá)的變化情況,用蛋白芯片分析的結(jié)果表明,分子量為23•56ku的蛋白在傷口愈合過(guò)程中表達(dá)量大幅度增加,加速了傷口的愈合。盡管蛋白質(zhì)芯片技術(shù)正逐漸得到廣泛應(yīng)用,但在應(yīng)用于尋找差異表達(dá)蛋白時(shí)也有局限性:1)待檢的低豐度蛋白往往被高豐度蛋白所掩蓋而不能檢測(cè)出來(lái),2)蛋白質(zhì)芯片系統(tǒng)對(duì)檢測(cè)小分子量的蛋白有效,檢測(cè)范圍為10~30ku,但是10~30ku的蛋白只是占總蛋白的一小部分。

1•2多維分離技術(shù)

對(duì)于復(fù)雜的蛋白質(zhì)樣品,比如特定組織或細(xì)胞中的所有蛋白質(zhì)(蛋白質(zhì)組),僅靠某一分離原理將它們分開(kāi)是不可能的,而要利用蛋白質(zhì)的不同性質(zhì)將它們分離開(kāi),由此而發(fā)展起來(lái)的分離技術(shù)叫多維分離技術(shù)(multidimensionalseparation)。目前主要采用的是二維分離技術(shù),因?yàn)閷?duì)于大多數(shù)蛋白質(zhì)的分離,采用蛋白質(zhì)間某兩個(gè)性質(zhì)的不同,利用二維分離技術(shù)已足夠了。其中,雙向電泳技術(shù)和二維液相色譜以及它們和質(zhì)譜的聯(lián)用,已成為當(dāng)今蛋白質(zhì)組學(xué)研究的有力工具。

1•2•1雙向電泳技術(shù):雙向電泳(two-dimensionalgelelectrophoresis,2-DE)技術(shù)是80年展起來(lái)的一種有效的二維分離技術(shù)。其原理是基于不同蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)和分子量不同的特性,第一相是等電聚焦電泳,第二相是SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。很多實(shí)驗(yàn)室利用不同的雙向電泳技術(shù)建立了特定組織或細(xì)胞的雙向電泳數(shù)據(jù)庫(kù)(2DPAGE),以供不同的實(shí)驗(yàn)室檢索和比較雙向電泳圖譜。SWISS-2DPAGE是一個(gè)經(jīng)注釋過(guò)的雙向電泳公共檢索數(shù)據(jù)庫(kù),其格式和SWISS-PROT蛋白序列數(shù)據(jù)庫(kù)類似。在SWISS-2DPAGE數(shù)據(jù)庫(kù)中包括蛋白質(zhì)的雙向電泳圖譜(其中標(biāo)明了蛋白質(zhì)的具置)、建立圖譜的具體方法和程序、以及相關(guān)的病理和生理數(shù)據(jù)。關(guān)于蛋白質(zhì)的雙向電泳數(shù)據(jù)可通過(guò)如下服務(wù)器進(jìn)行檢索:expasy•hcuge•ch/。在功能基因組時(shí)代,雙向電泳技術(shù)除了用于分離復(fù)雜的蛋白樣品,建立雙向電泳數(shù)據(jù)庫(kù)外,主要用于尋找不同組織或細(xì)胞中差異表達(dá)的蛋白質(zhì),以進(jìn)行疾病相關(guān)蛋白或基因的研究。先用pH3-10的IPG膠條,對(duì)疾病組織和正常組織進(jìn)行雙向電泳分離,然后利用計(jì)算機(jī)軟件對(duì)所產(chǎn)生的2-DE圖譜進(jìn)行分析,找出差異表達(dá)的蛋白。

如果想得到更為詳細(xì)的2-DE圖譜,可用pH4-7或pH6-9的膠條,甚至只有一個(gè)pH單位的窄pH范圍的膠條,從而使分辨率大大提高。將找到的差異表達(dá)蛋白斑點(diǎn)從膠上切下來(lái),經(jīng)酶消化(常用胰蛋白酶),通過(guò)質(zhì)譜(MS)或串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)測(cè)定和數(shù)據(jù)庫(kù)搜索,鑒定出所差異表達(dá)蛋白。然而,雙向電泳技術(shù)有許多局限性,由于樣品處理的差別、翻譯后修飾、人為修飾等導(dǎo)致同一基因表達(dá)的蛋白質(zhì)遷移到不同的位置;另外,不同的蛋白也會(huì)遷移到同一斑點(diǎn),出現(xiàn)共遷移現(xiàn)象,從而使得用2-DE進(jìn)行定性和定量分析變得相當(dāng)復(fù)雜。而且,對(duì)于低豐度和低拷貝數(shù)蛋白的檢測(cè)也相當(dāng)困難。雙向電泳要求操作者熟練掌握電泳、染色及軟件分析技術(shù),整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中要穿實(shí)驗(yàn)服,戴手套,盡量避免角蛋白等污染,才能得到較好的重復(fù)性。為了改進(jìn)雙向電泳的重復(fù)性和靈敏度,最近發(fā)展了一種熒光染料標(biāo)記的雙向電泳技術(shù)即凝膠內(nèi)差別電泳(differentialin-gelelec-trophoresis,DIGE)[7]。將樣品和對(duì)照品分別用1-(5-羧戊基)-1′-丙基靛碳氰鹵化物(Cy3)N-羥基琥珀酸酯[1-(5-carboxypentyl)-1′-propylindocarbocyaninehalinge(Cy3)N-hydroxy-succinimidylester]和1-(5-羧戊基)-1′-甲基靛碳氰鹵化物(Cy5)N-羥基琥珀酸酯[1-(5-carboxypentyl)-1′-methylindocarbocyaninehalinge(Cy5)N-hydroxy-succinimidylester]標(biāo)記。在DIGE時(shí),由于樣品和對(duì)照在同一膠內(nèi)分離,使用相同的內(nèi)標(biāo),避免了使用不同凝膠時(shí)在操作上的偶然性和不平行性,可以準(zhǔn)確檢測(cè)出兩個(gè)不同樣品蛋白表達(dá)上的差別,消除膠與膠之間的差異,保證統(tǒng)計(jì)上的可靠性及操作上的重復(fù)性。熒光標(biāo)記較其他染色方法靈敏度更高。與常規(guī)的雙向電泳技術(shù)比較,DIGE更加簡(jiǎn)單,勞動(dòng)強(qiáng)度大大降低,效率大大提高。

1•2•2多維液相色譜-質(zhì)譜技術(shù):液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜儀用于小分子和大分子的分離和鑒定是一項(xiàng)常規(guī)而重要的技術(shù),將液相色譜和質(zhì)譜用于蛋白質(zhì)組的研究,尤其是差異表達(dá)蛋白質(zhì)組的研究,是最近才發(fā)展起來(lái)的。目前,利用多維液相色譜-質(zhì)譜進(jìn)行差異表達(dá)蛋白的研究,通常要借助于同位素標(biāo)記技術(shù),也即是下面所述的ICAT技術(shù)。ICAT技術(shù)是指采用同位素標(biāo)記多肽或蛋白質(zhì)的親和標(biāo)簽技術(shù)(isotopecoded-affinitytags,ICAT),可以較準(zhǔn)確的鑒定出不同狀態(tài)細(xì)胞或組織中差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。目前的ICAT試劑,大多是用來(lái)標(biāo)記磷酸化蛋白的[8]。對(duì)于酵母和細(xì)菌細(xì)胞,可在培養(yǎng)基中加入同位素進(jìn)行標(biāo)記。另外,在蛋白酶解的過(guò)程中,可采用18O對(duì)蛋白樣品的片段進(jìn)行標(biāo)記,而對(duì)照品不用同位素標(biāo)記。當(dāng)使用胰酶、Glu-C或Lys-C等蛋白酶時(shí),可分別引入2個(gè)18O到正在被酶解的肽中?，F(xiàn)在流行的市售ICAT試劑由美國(guó)華盛頓大學(xué)GygiSP教授[9]等人首先報(bào)道。此ICAT試劑的結(jié)構(gòu)包括三個(gè)部分:生物素親和標(biāo)簽,用于分離ICAT標(biāo)記的多肽;中部的連接子,使引入的同位素更穩(wěn)定;反應(yīng)活性基團(tuán),可和半胱氨酸的巰基發(fā)生特異性反應(yīng)。此試劑以兩種形式存在,重試劑(含同位素氘)和輕試劑(不含同位素),前者的質(zhì)量數(shù)比后者多8。利用ICAT試劑標(biāo)記蛋白,尋找差異表達(dá)蛋白質(zhì)的原理是:當(dāng)樣品和對(duì)照分別用重試劑和輕試劑標(biāo)記后,將兩樣品混合,酶解,過(guò)鏈親和素柱,使ICAT標(biāo)記的肽片段吸附在鏈親和素柱上。將ICAT標(biāo)記的肽洗脫下來(lái),經(jīng)液相色譜-質(zhì)譜分析。樣品和其對(duì)照表達(dá)量的差別可用質(zhì)譜峰的強(qiáng)度(面積)進(jìn)行定量。將所得的差別峰經(jīng)進(jìn)一步的串聯(lián)質(zhì)譜分析,數(shù)據(jù)庫(kù)搜索,從而鑒定出相應(yīng)的差異表達(dá)蛋白質(zhì),并進(jìn)行進(jìn)一步的功能鑒定,如Westernblot等。用這種ICAT試劑尋找差異表達(dá)蛋白的缺點(diǎn)是只對(duì)含半胱氨酸殘基的蛋白質(zhì)有效,而不能測(cè)定其它的蛋白質(zhì)和多肽。

2疾病診斷與藥物開(kāi)發(fā)

蛋白質(zhì)組學(xué)方法除了在基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究中用于尋找差異表達(dá)蛋白質(zhì),進(jìn)而找出疾病相關(guān)蛋白質(zhì)外,在疾病基因組學(xué)與藥物基因組學(xué)的研究中還具有以下幾個(gè)方面的作用。

2•1鑒定和疾病相關(guān)的生物標(biāo)記分子

蛋白質(zhì)組學(xué)方法在基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究中的優(yōu)點(diǎn)在于,可以高通量的方式篩選和鑒定和疾病相關(guān)的生物標(biāo)記分子,用于臨床診斷。HeineG[10]等人利用腦脊液作材料,經(jīng)過(guò)雙向電泳分離后的蛋白斑點(diǎn),用液相色譜-質(zhì)譜分離鑒定,得到了腦脊液的高分辨率肽譜。因腦脊液的肽中包括許多激素、細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子,在生物體中起著關(guān)鍵作用,它們以多種方式反映機(jī)體體內(nèi)平衡中和疾病相關(guān)的變化,如果能從這些肽中鑒定出疾病相關(guān)的標(biāo)記分子,將可從肽水平上調(diào)查中樞神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病,因而是一種疾病診斷和治療的新方法。KuererHM[11]等人利用高通量的雙向電泳技術(shù),分析乳腺管流體(breastductalfluid)中生化和細(xì)胞成分,以監(jiān)測(cè)乳腺癌的發(fā)生和進(jìn)展情況。BrunagelG[12]等人則根據(jù)核基質(zhì)蛋白和結(jié)腸癌的相關(guān)性,利用雙向電泳技術(shù)鑒定病人的肝樣品中是否有核基質(zhì)蛋白,從而判斷結(jié)腸癌病人是否發(fā)生肝轉(zhuǎn)移,以此作為結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的早期診斷。對(duì)于蛋白芯片技術(shù),在基礎(chǔ)研究中常用于檢測(cè)蛋白質(zhì)修飾、表征蛋白質(zhì)相互作用、信號(hào)傳導(dǎo)以及酶動(dòng)力學(xué)研究等。在臨床上,廣泛用于尋找疾病相關(guān)的生物標(biāo)記分子和疾病診斷。WuW[13]等用SELDI-蛋白芯片技術(shù)鑒定了來(lái)自同一病人的兩種頭頸部鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株HBSCC10A和VMSCC10B中蛋白的差異表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),α-烯醇酶、annexin-Ⅰ和annex-in-Ⅱ是頭頸部鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移的重要分子,以這些分子作為生物標(biāo)記分子,用于頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的臨床診斷。對(duì)于多維液相或毛細(xì)管液相色譜-質(zhì)譜技術(shù),由于可進(jìn)行連續(xù)和微量檢測(cè),在尋找疾病相關(guān)的生物標(biāo)記分子方面具有超強(qiáng)的靈敏度。可進(jìn)行大體積、低豐度蛋白的分析,如對(duì)血清樣品[14]和尿液[15]進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)的研究。

2•2藥物開(kāi)發(fā)

因?yàn)榈鞍踪|(zhì)直接決定生物體處于健康或疾病狀態(tài),所以,蛋白質(zhì)可作為藥物設(shè)計(jì)和開(kāi)發(fā)的藥靶。利用蛋白質(zhì)組學(xué)方法研究健康或疾病生物體蛋白間的相互關(guān)系、疾病病理基礎(chǔ)、鑒定藥物成分、毒性和作用機(jī)理,從而改進(jìn)藥效和藥物安全性。MujerCV[16]等利用雙向電泳和質(zhì)譜技術(shù),分析了布魯氏桿菌(Brucellamelitensis,BM)的蛋白質(zhì)組。BM是一種細(xì)胞內(nèi)兼性革蘭氏陰性桿菌,可引起人或動(dòng)物的布魯氏熱(brucellosis)。此桿菌的一個(gè)屬中至少有6個(gè)種。利用雙向電泳和質(zhì)譜技術(shù),分析了BM致病株16M的蛋白表達(dá)模式,并鑒定了所有表達(dá)的蛋白質(zhì),對(duì)6種布魯氏桿菌減毒疫苗Rev1的蛋白圖譜進(jìn)行了廣泛研究。從而為發(fā)展疫苗,鑒定致病島(patho-genicityisland),建立宿主專一性、進(jìn)化相關(guān)性及疾病治療和藥物開(kāi)發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

2•3致病機(jī)理研究

用蛋白質(zhì)組學(xué)方法研究疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中某些蛋白或多肽水平的變化,從而了解疾病發(fā)生的機(jī)理,如對(duì)慢性髓性白血病(chronicmyeloidleukemia,CML)分子機(jī)理的研究[17]。此病為造血干細(xì)胞疾病,標(biāo)記分子為Bcr-Abl蛋白酪氨酸激酶。讓全能的骨髓干細(xì)胞株(FDCP-Mix)有條件的表達(dá)Bcr-Abl蛋白酪氨酸激酶,從而使FDCP-Mix細(xì)胞株長(zhǎng)期暴露于Bcr-Abl中,模擬CML疾病進(jìn)程。用長(zhǎng)期暴露和短期暴露進(jìn)行對(duì)照,用MALDI-Tof質(zhì)譜或LC-MS進(jìn)行鑒定。分析結(jié)果表明,白三烯(Leukotriene)A4水解酶的表達(dá)上調(diào),AnnexinⅥ、液泡ATP合成酶催化亞單位A及mortain的表達(dá)下調(diào),表明這些分子在CML的發(fā)生中發(fā)揮重要作用。將蛋白質(zhì)組學(xué)方法用于疾病機(jī)理研究的例子很多,這里不再贅述。

篇2

現(xiàn)代質(zhì)譜技術(shù)作為蛋白質(zhì)組學(xué)支撐技術(shù)之一，在蛋白質(zhì)和肽段的鑒定、定量和結(jié)構(gòu)分析方面起著非常重要的作用。質(zhì)譜分析進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定和序列測(cè)定的基本原理是使用電噴霧離子化和基質(zhì)輔助激光解吸離子化的軟電離方法，經(jīng)酶切后的蛋白質(zhì)肽段或完整蛋白質(zhì)帶上電荷，然后根據(jù)不同離子間的質(zhì)荷比的差異來(lái)分離并確定相對(duì)質(zhì)量。樣品分子進(jìn)行上述方法電離時(shí)能保留整個(gè)分子，確保了完整性而不會(huì)形成碎片離子，稱為肽質(zhì)量指紋圖譜（PMF）技術(shù)。PMF是一種現(xiàn)在運(yùn)用最廣的用來(lái)鑒定2-DE分離出來(lái)的蛋白質(zhì)和肽的方法，伴隨著現(xiàn)代質(zhì)譜技術(shù)的不斷發(fā)展，其在蛋白質(zhì)組學(xué)中的應(yīng)用將越來(lái)越廣泛。

高效液相色譜及多維液相色譜高效液相色譜（HPLC）技術(shù)最初被用于分離蛋白質(zhì)或多肽。現(xiàn)在，HPLC已成功應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，它是基于樣品分子在固定相（柱填料）和流動(dòng)相（淋洗液）間的特殊相互作用而實(shí)現(xiàn)樣品分離的。無(wú)須變性處理樣品，可實(shí)現(xiàn)上樣收集及在線分析的自動(dòng)化。利用液相色譜結(jié)合電噴霧質(zhì)譜（ESI-MS）而不依賴于2-DE，也可以分析磷肽或糖肽，先由特異性的胰蛋白酶消化，產(chǎn)生的多肽由強(qiáng)陽(yáng)離子交換柱和反相HPLC分離后經(jīng)ESI-MS/MS分析。液相色譜與MS聯(lián)用，采用高速且高靈敏度的色譜分離法來(lái)代替耗時(shí)的2-DE蛋白質(zhì)分離法，故其與經(jīng)典的2-DE-MS法相比，具有快速、樣品需要量少和多肽分離的通用性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，將會(huì)在不同酪蛋白形式的分子特性描述中得到更進(jìn)一步的應(yīng)用。但由于層析填充物對(duì)許多蛋白質(zhì)組分有吸附作用，且難以實(shí)現(xiàn)多組分蛋白質(zhì)樣品的多維層析，因此僅適用于研究單一蛋白質(zhì)或簡(jiǎn)單樣品蛋白質(zhì)組。多維液相色譜（MLC）則是利用與串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用，可以檢測(cè)低豐度肽段，是目前蛋白質(zhì)組學(xué)研究最新的技術(shù)，可快速并高通量鑒定復(fù)雜蛋白質(zhì)混合物。

蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在畜禽動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)中的應(yīng)用

傳統(tǒng)肉類生產(chǎn)中的飼養(yǎng)管理、飼料結(jié)構(gòu)、飼喂方式和飼養(yǎng)密度在基于動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)和飼料工業(yè)的現(xiàn)代肉類生產(chǎn)的出現(xiàn)后，發(fā)生了本質(zhì)性的改變。同時(shí)，大規(guī)模的現(xiàn)代肉類生產(chǎn)影響到了飼養(yǎng)動(dòng)物的生理學(xué)、行為學(xué)和生物化學(xué)過(guò)程，隨之導(dǎo)致了肉品品質(zhì)的下降。同時(shí)生產(chǎn)者為了增大產(chǎn)量和減少疾病風(fēng)險(xiǎn)，在養(yǎng)殖過(guò)程中濫用抗生素等化學(xué)藥物，加劇了肉類品質(zhì)的惡化。此外，為了追求提高肉類的某些性能，忽視了飼養(yǎng)動(dòng)物的體質(zhì)健康、外部形狀與內(nèi)在機(jī)能的協(xié)調(diào)，生理學(xué)的平衡和整體適應(yīng)性，從而導(dǎo)致現(xiàn)代肉用動(dòng)物（豬和雞）對(duì)周圍環(huán)境條件的高度敏感性，最終導(dǎo)致了肉品的食用品質(zhì)，如：色澤、風(fēng)味和嫩度等下降，PSE肉的比例升高，肉中的抗生素殘留現(xiàn)象極為突出。鑒于此，對(duì)肉品品質(zhì)進(jìn)行評(píng)價(jià)并對(duì)其進(jìn)行可能的等級(jí)標(biāo)注及對(duì)其生產(chǎn)過(guò)程控制，對(duì)于現(xiàn)代肉品生產(chǎn)至關(guān)重要。蛋白質(zhì)是肌肉組織的重要組成成分，研究表明：肉類品質(zhì)研究與功能蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)研究間密不可分，蛋白組變化可能與肉的嫩度相關(guān)。肌纖維分紅肌纖維和白肌纖維2種類型，這2種類型在代謝水平上存在著結(jié)構(gòu)和功能的差異。纖維類型與肉質(zhì)性狀，如：性、風(fēng)味和嫩度等的關(guān)系存在著很多爭(zhēng)議，尤其是纖維類型對(duì)肉嫩度的影響仍然不清。Lametsch等首次利用蛋白質(zhì)組學(xué)分析屠宰后豬肌肉的變化情況，采集了剛屠宰至屠宰后48h的肌肉蛋白質(zhì)組樣品，這些肌肉蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量介于5000~20萬(wàn)不等，pH在4~9，結(jié)果發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)組模式發(fā)生了15種顯著的變化。此后的研究中Lametsch等最終確定了可作為肉品質(zhì)標(biāo)記的20多種蛋白質(zhì)，包括結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)（肌動(dòng)蛋白、肌球蛋白和肌鈣蛋白）和代謝酶（肌激酶、丙酮酸激酶和糖原磷酸化酶）。在這些標(biāo)記蛋白中，人們發(fā)現(xiàn)肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白重鏈與肌肉的剪切力間存在極顯著的相關(guān)，這就清楚地表明屠宰后肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白重鏈的降解會(huì)影響肉的質(zhì)量。Remignon等直接對(duì)肌肉蛋白質(zhì)片段進(jìn)行分析，認(rèn)為蛋白質(zhì)的改變很可能是導(dǎo)致家禽PSE肉綜合征的直接原因。Molette等研究發(fā)現(xiàn)火雞屠宰后胸肌糖酵解的速度比較快（屠宰后每20minpH比正常的多下降0.5），從而使得肉品質(zhì)發(fā)生改變，如：系水力下降、加工產(chǎn)量降低和嫩度降低等。同樣報(bào)道了糖酵解快的動(dòng)物肉的系水力低，并且提取到的肌漿蛋白含量低，這表明當(dāng)pH下降的速率加快時(shí)蛋白質(zhì)功能發(fā)生了改變。

蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在水產(chǎn)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)中的應(yīng)用

蛋白質(zhì)組學(xué)方法在水產(chǎn)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)特別是魚的品質(zhì)鑒定中已有應(yīng)用，目前也被廣泛應(yīng)用到了對(duì)蝦和海蜇等的品質(zhì)控制中。隨著對(duì)魚類水產(chǎn)品的需求日益增長(zhǎng)，保障和控制其安全生產(chǎn)具有重要的意義。在以數(shù)量增長(zhǎng)為主的水產(chǎn)集約化養(yǎng)殖、運(yùn)輸和銷售過(guò)程中，擁擠應(yīng)激是常見(jiàn)的影響水產(chǎn)品食用品質(zhì)的因素，解凍程序同樣深刻地影響水產(chǎn)的品質(zhì)。近年來(lái)，蛋白質(zhì)組學(xué)已被廣泛地應(yīng)用到了水產(chǎn)品品質(zhì)控制。Inger等利用2-DE技術(shù)研究新鮮的鱈魚與死后鱈魚肌肉，發(fā)現(xiàn)有11個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)的豐度發(fā)生了變化，其中8個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)的豐度顯著增加，后續(xù)分析表明：這些蛋白質(zhì)點(diǎn)是肌原蛋白、肌漿蛋白和肌肉纖維等肌肉組織的分解產(chǎn)物。由此可見(jiàn)，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)評(píng)價(jià)魚肉鮮度等品質(zhì)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。Kjaersgard等通過(guò)對(duì)11種不同冷凍儲(chǔ)存條件下對(duì)鱈魚肌肉蛋白質(zhì)圖譜進(jìn)行研究分析，發(fā)現(xiàn)不同冷凍儲(chǔ)存溫度對(duì)蛋白質(zhì)圖譜并無(wú)顯著影響，但經(jīng)過(guò)不同的冷凍儲(chǔ)存時(shí)間（3、6和12個(gè)月），肌漿球蛋白輕鏈、磷酸丙糖異構(gòu)酶、醛縮酶A和2-α肌動(dòng)蛋白片段等蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度發(fā)生了顯著變化，從而導(dǎo)致魚肉的質(zhì)地和味道發(fā)生了變化。Martinez等通過(guò)研究人工養(yǎng)殖的鱈魚與野生的鱈魚，比較發(fā)現(xiàn)人工養(yǎng)殖的鱈魚2-DE圖上蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量在3.5萬(wàn)~4.5萬(wàn)間存在顯著差異。然而目前蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在水產(chǎn)養(yǎng)殖和貯藏加工過(guò)程中的研究還處于起步階段，隨著相關(guān)技術(shù)的發(fā)展，將在水產(chǎn)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)中起到更加重要的作用。

篇3

【摘要】 作為后基因時(shí)代的一門新學(xué)科，蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)為線粒體蛋白質(zhì)組的研究提供了有力的支持，使得從整體上研究線粒體蛋白質(zhì)組在生理、病理過(guò)程中的變化成為可能. 本文回顧了近年來(lái)國(guó)外學(xué)者應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法揭示相關(guān)疾病線粒體蛋白質(zhì)存在相應(yīng)的變化，以及通過(guò)對(duì)線粒體蛋白質(zhì)組的研究去發(fā)現(xiàn)線粒體蛋白質(zhì)在疾病發(fā)生發(fā)展中的作用，從而為尋找與疾病密切相關(guān)的疾病特異性蛋白提供線索.

【關(guān)鍵詞】 線粒體；疾??；蛋白質(zhì)組學(xué)

0引言

二十一世紀(jì)初，人類基因組計(jì)劃基本完成. 生命科學(xué)研究步入了后基因時(shí)代，其核心便是蛋白質(zhì)組研究. 蛋白質(zhì)組被定義為：一種細(xì)胞、組織或完整的生物體所擁有的全套的蛋白質(zhì). 這是一個(gè)整體的、動(dòng)態(tài)的概念.而蛋白質(zhì)組學(xué)是研究這些成分在指定時(shí)間或特定環(huán)境條件下的表達(dá). 因?yàn)榈鞍踪|(zhì)是我們理解細(xì)胞功能和疾病過(guò)程的核心，如果在蛋白質(zhì)組學(xué)方面沒(méi)有共同的努力，基因組學(xué)的成果將不會(huì)成為現(xiàn)實(shí). 蛋白質(zhì)組學(xué)現(xiàn)在被認(rèn)為是一個(gè)在診斷和發(fā)現(xiàn)伴隨細(xì)胞器變化的復(fù)雜疾病的強(qiáng)有力的工具. 迅速發(fā)展的蛋白質(zhì)組學(xué)也推動(dòng)了線粒體蛋白質(zhì)組的研究發(fā)展.

近年來(lái)國(guó)外學(xué)者應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法揭示相關(guān)疾病線粒體蛋白質(zhì)存在相應(yīng)的變化，并通過(guò)對(duì)線粒體蛋白質(zhì)組的研究去發(fā)現(xiàn)線粒體蛋白質(zhì)在疾病發(fā)生發(fā)展中的作用，從而為尋找與疾病密切相關(guān)的疾病特異性蛋白提供線索. 現(xiàn)就近年來(lái)，相關(guān)疾病線粒體蛋白質(zhì)組的研究進(jìn)展作一綜述.

1線粒體相關(guān)疾病蛋白質(zhì)組學(xué)研究

線粒體是真核細(xì)胞中最復(fù)雜和最重要的細(xì)胞器之一，哺乳動(dòng)物除成熟紅細(xì)胞外，線粒體普遍存在于有氧呼吸的真核細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中. 它是細(xì)胞內(nèi)的能量供應(yīng)中心，與氧自由基生成有關(guān). 線粒體在脂肪酸代謝、嘧啶生物合成、體內(nèi)鈣平衡，以及細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中起著主要作用. 同時(shí)，線粒體也是人類“另一”個(gè)來(lái)源于母系基因組的所在地. 許多細(xì)胞進(jìn)程，如凋亡、老化以及多種疾病病理學(xué)機(jī)制(包括癌、肌病、糖尿病、肥胖、老化、特別是神經(jīng)退行性疾病等)都與線粒體功能障礙或突變有關(guān)［1-2］. 在人類線粒體中約有1500個(gè)蛋白質(zhì)［3］，其中已經(jīng)有600多種蛋白質(zhì)被鑒定出來(lái). 如果能鑒定出大部分，甚至全部蛋白質(zhì)那將是非常寶貴的資源. 蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)為研究線粒體疾病和線粒體功能失調(diào)，為尋找疾病診斷的標(biāo)志物，探索藥物作用靶點(diǎn)提供了必不可少的手段. 成為臨床、基礎(chǔ)研究的熱點(diǎn).

1.1神經(jīng)系統(tǒng)疾病

1.1.1神經(jīng)退行性疾病帕金森?。菏且环N中老年人常見(jiàn)的運(yùn)動(dòng)障礙疾病，以黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元變性缺失和路易小體形成為病理特征［4］. 目前，導(dǎo)致黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元變性缺失的確切發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，但是已經(jīng)知道線粒體功能障礙在其中起了重要作用. 采用定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)和同位素編碼標(biāo)記物方法，Jin等［5］對(duì)使用1甲基4苯基1，2，3，6四氫吡啶（MPTP）輔以二丙苯磺胺（probenecid）處理5 wk的慢性帕金森病小鼠和對(duì)照小鼠，進(jìn)行了二組間黑質(zhì)線粒體蛋白表達(dá)譜的差異表達(dá)比較. 辨別出超過(guò)300個(gè)蛋白點(diǎn). 比較處理組和對(duì)照組中這些蛋白點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)超過(guò)100個(gè)蛋白點(diǎn)在處理組中有量上的顯著變化，經(jīng)鑒定其中有一個(gè)蛋白質(zhì)為：DJ1，它的突變與家族性帕金森病有關(guān). 采用蛋白印記分析和免疫組化方法得出，其在黑質(zhì)的分布與鼠細(xì)胞內(nèi)包涵體形成有關(guān). 包涵體如同帕金森患者中的路易小體. 這一結(jié)果說(shuō)明DJ1不僅與α突觸核蛋白同時(shí)聚集在多巴胺能神經(jīng)元中，還存在于經(jīng)MPTP/prob處理的小鼠細(xì)胞包涵體內(nèi). 這一結(jié)果表明：在線粒體功能缺陷和帕金森病患者路易小體的形成中，DJ1可能起了重要作用.

阿爾茨海默?。菏抢夏耆酥谐Ｒ?jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病. 日益增多的證據(jù)表明新陳代謝異常和氧化應(yīng)激所致線粒體功能缺陷與阿爾茨海默病相關(guān). David等［6］采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)阿爾茨海默病的P301L Tau轉(zhuǎn)基因小鼠的蛋白質(zhì)表達(dá)譜進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，主要是與新陳代謝相關(guān)的蛋白：包括線粒體呼吸鏈復(fù)合物組成部分、抗氧化劑酶、突觸蛋白等都有改變. 隨后的功能分析提示，Tau蛋白和β淀粉樣蛋白對(duì)線粒體損傷有協(xié)同作用.

1.1.2家族性肌萎縮側(cè)索硬化癥肌萎縮側(cè)索硬化癥是運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病最常見(jiàn)的類型，肌萎縮側(cè)索硬化癥是一種致命的神經(jīng)變性疾病，特征是運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的不斷死亡. 大約10%的肌萎縮側(cè)索硬化癥患者是家族遺傳病例. 肌萎縮側(cè)索硬癥已被公認(rèn)與銅/鋅超氧化物歧化酶（Cu/Zn super oxide dismutase gene，SOD1）基因突變有關(guān)，其在家族性遺傳性病例中占20%. 至今已有超過(guò)90種基因突變類型被發(fā)現(xiàn). 不斷積累的研究證據(jù)表明，在家族性肌萎縮側(cè)索硬化癥的病因?qū)W中線粒體功能障礙和細(xì)胞凋亡的激活起了重要作用. 但是很少知道哪個(gè)SOD1基因突變導(dǎo)致了線粒體功能障礙和細(xì)胞凋亡. 應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)方法，F(xiàn)ukada等［7］對(duì)NSC34細(xì)胞的G93ASOD1型所致的家族性肌萎縮側(cè)索硬化癥的線粒體蛋白質(zhì)改變進(jìn)行了研究. 采用兩種獨(dú)立的蛋白質(zhì)組學(xué)方法，在線粒體斷片中辨別出470個(gè)蛋白點(diǎn)，其中有75個(gè)是新發(fā)現(xiàn)的，這些蛋白以前只在cDNA水平報(bào)道過(guò). 隨后，他們采用2DPAGE方法分析了NSC34細(xì)胞野生型和NSC34細(xì)胞的G93ASOD1型的線粒體蛋白質(zhì)組表達(dá)譜的區(qū)別. 在G93ASOD1型表達(dá)譜中，有9個(gè)點(diǎn)顯示高表達(dá)，36個(gè)點(diǎn)低表達(dá). 運(yùn)用MS鑒定這45個(gè)點(diǎn)，這些蛋白點(diǎn)包含了有關(guān)線粒體膜轉(zhuǎn)運(yùn)、凋亡、呼吸鏈和分子伴侶蛋白等. 特別是發(fā)現(xiàn)，翻譯后修飾的電壓依賴性陰離子通道2蛋白的改變，該蛋白與線粒體膜滲透性的調(diào)節(jié)和細(xì)胞凋亡激活之間的關(guān)聯(lián)正在激烈地討論之中. 該研究所發(fā)現(xiàn)的這些線粒體蛋白，很可能是揭開(kāi)SOD1突變導(dǎo)致線粒體功能障礙和細(xì)胞凋亡的鑰匙.

1.1.3癲癇癲癇是一組由不同病因引起，腦部神經(jīng)元高度同步化、且常具有自限性的異常放電所致疾病. 臨床表現(xiàn)具有發(fā)作性、短暫性、重復(fù)性以及刻板性的中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能失常為特征的綜合征. Kammer等［8］對(duì)點(diǎn)燃小鼠的腦組織采用2DE和質(zhì)譜分析技術(shù)鑒定出了一種變異的Rieske鐵硫蛋白（Rieske ironsulfur protein）. Rieske鐵硫蛋白是線粒體復(fù)合物Ⅲ的一部分. 研究顯示，在癲癇發(fā)作中Rieske蛋白可能對(duì)神經(jīng)元的反應(yīng)起一定作用，從而在癲癇的分子發(fā)病機(jī)制上提出了一種新見(jiàn)解.

1.2心臟病擴(kuò)張型心肌病是一種嚴(yán)重的可導(dǎo)致心衰的心臟病. Knecht等［9］采用雙向電泳（2DE，2D electrophoresis）取得了3300個(gè)心肌蛋白條帶. 通過(guò)氨基酸序列分析、Edman降解法及基質(zhì)輔助的激光解吸離子化質(zhì)譜（matrixassisted laser desorption MALD mass spectrometry MS）等方法分析了其中150條帶. 經(jīng)活檢及術(shù)后病理證實(shí)，其中有12條為擴(kuò)張性心肌病特有的蛋白質(zhì). Arnott等對(duì)新福林誘導(dǎo)的肥大心肌細(xì)胞進(jìn)行線粒體蛋白質(zhì)組分析，與對(duì)照樣品相比較發(fā)現(xiàn)有8種蛋白質(zhì)的表達(dá)水平發(fā)生了不同程度的變化. 對(duì)存在缺血再灌注區(qū)、被預(yù)先處理的局部缺血兔心和正常兔心線粒體斷片，Kim等［10］應(yīng)用蛋白組學(xué)技術(shù)檢測(cè)其蛋白表達(dá)水平的差異. 采用2DE，辨別出25個(gè)線粒體蛋白，在缺血再灌注心肌中出現(xiàn)了不同程度的表達(dá). 鑒定出的大部分蛋白與線粒體呼吸鏈和能量代謝有關(guān). 同時(shí)表明，要鑒定因缺血所致心肌損害的生物標(biāo)志物，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)為其提供了一個(gè)適當(dāng)?shù)氖侄?

1.3其他疾病

1.3.1乙醇依賴性肝損傷對(duì)暴露于慢性乙醇的動(dòng)物模型，Venkatraman等［11］運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)方法進(jìn)行了肝線粒體蛋白水平變化的分析，結(jié)果顯示43個(gè)點(diǎn)出現(xiàn)不同水平的改變. 其中13個(gè)點(diǎn)上調(diào)而另30個(gè)點(diǎn)下降. 在這些蛋白中，以前并不知道的25個(gè)蛋白發(fā)生了改變. 研究結(jié)果表明，長(zhǎng)期飲酒導(dǎo)致的線粒體蛋白質(zhì)組的改變遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了人們的預(yù)先估計(jì). 在長(zhǎng)期乙醇喂養(yǎng)的小鼠線粒體中所有核和線粒體編碼基因產(chǎn)物中的氧化磷酸化復(fù)合物均有下降，說(shuō)明在整個(gè)代謝通路中存在合成障礙.

1.3.2腫瘤隨著線粒體功能蛋白質(zhì)組學(xué)研究的發(fā)展，已經(jīng)有可能鑒定出癌細(xì)胞中線粒體蛋白表達(dá)的異常，并有可能鑒定出新產(chǎn)生的生物標(biāo)記物，并以此來(lái)作為早期檢測(cè)和進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的指標(biāo)［12］. Herrmann等［13］采用蛋白組學(xué)技術(shù)定量分析了，線粒體編碼細(xì)胞色素C氧化酶亞單位和核編碼細(xì)胞色素C氧化酶亞單位的比率，發(fā)現(xiàn)該比率與前列腺組織惡性進(jìn)程相關(guān). 在從正常上皮組織通過(guò)癌前病變發(fā)展到浸潤(rùn)性癌的過(guò)程中，核編碼細(xì)胞色素C氧化酶亞單位IV， Vb， Vic與線粒體編碼細(xì)胞色素C氧化酶亞單位I 和 II 之間相對(duì)濃度的比率有很顯著的變化. 顯然這一改變發(fā)生在惡化的早期階段，充分顯示了核DNA編碼的線粒體蛋白在致癌上起了作用，為尋找潛在的生物標(biāo)志物提供了依據(jù).

1.3.3內(nèi)毒素血癥內(nèi)毒素休克導(dǎo)致的器官功能衰竭現(xiàn)在已經(jīng)被認(rèn)為與線粒體功能受損相關(guān)聯(lián). Miller等［14］運(yùn)用2DE及MS技術(shù)，通過(guò)對(duì)存在脂多糖免疫反應(yīng)的大鼠肝線粒體蛋白質(zhì)和對(duì)照組進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)ATP合酶α鏈、超氧化物歧化酶有顯著的增量調(diào)節(jié). 這些結(jié)果提示，內(nèi)毒素休克介導(dǎo)的線粒體蛋白組改變促進(jìn)了代償反應(yīng)（適應(yīng)內(nèi)毒素休克），而不是細(xì)胞損傷所致. Crouser等［15］也對(duì)內(nèi)毒素血癥中線粒體蛋白質(zhì)組變化作了研究. 采用經(jīng)靜脈注入內(nèi)毒素（3.0 mg/kg），以成年雄性貓和未處理的貓作對(duì)照，經(jīng)2DE發(fā)現(xiàn)兩組動(dòng)物的肝線粒體蛋白表達(dá)譜有14個(gè)點(diǎn)不同. 質(zhì)譜分析表明鳥氨酸循環(huán)酶、熱休克蛋白60、二氧化錳超氧化劑岐化酶高表達(dá)，而熱休克蛋白70、F(1)ATP酶和調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵酶表達(dá)降低. 他們認(rèn)為在內(nèi)毒素血癥中線粒體功能有明顯改變.

1.4老化關(guān)于老化過(guò)程的信息可以通過(guò)認(rèn)識(shí)蛋白表達(dá)的改變來(lái)獲得. Kim等［16］用2DE方法，對(duì)13 mo（年幼）和31 mo（年老）大小的雄性Fischer344大鼠腎的線粒體斷片進(jìn)行了差別分析. 電泳圖譜中檢測(cè)出380個(gè)點(diǎn)，其中167個(gè)點(diǎn)二者比較有顯著性差異，再通過(guò)應(yīng)用基質(zhì)輔助的激光解吸及電離時(shí)間飛行質(zhì)譜鑒定了其中103個(gè)蛋白. 在年老的線粒體斷片中顯示出，抗氧化和蛋白水解的蛋白增多，細(xì)胞骨架蛋白減少. 他們認(rèn)為：通過(guò)對(duì)蛋白表達(dá)的蛋白質(zhì)組學(xué)分析，可有效的評(píng)估年齡狀態(tài). Kiri等［17］也做了類似實(shí)驗(yàn)，他們對(duì)3~8 mo（年幼）牛心和18~24 mo（成年）牛心線粒體運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)進(jìn)行蛋白分離和鑒定. 在PH 5~8范圍中選取鑒定40個(gè)蛋白點(diǎn)，40個(gè)點(diǎn)中有5個(gè)蛋白只存在于成年，而另有5個(gè)蛋白只存在于年幼的牛心，有8個(gè)蛋白的量在兩組中比較至少相差2倍以上. 這些蛋白中有與能量生成、新陳代謝密切相關(guān)的酶，線粒體蛋白合成延伸酶等. 這些氧化修飾蛋白很可能與促成心臟蛋白年齡相關(guān)性退化和功能減退有關(guān).

1.5毒理學(xué)研究為研究錳對(duì)線粒體的毒性，Zhang等［18］對(duì)經(jīng)二氯化錳（30 mg/kg）處理的雄性斯普拉道來(lái)大鼠的腦的線粒體，應(yīng)用考馬斯藍(lán)染色，2DPAGE分離出超過(guò)300個(gè)點(diǎn)在. 與對(duì)照組相比，有3個(gè)點(diǎn)被抑制，3個(gè)點(diǎn)被誘導(dǎo). 通過(guò)MALDITOF鑒定了有ATP依賴鈣離子泵、60 000熱休克蛋白、線粒體跨膜鳥苷三磷酸酶FZO1B、長(zhǎng)鏈脂肪酸CoA連接酶、ATP合酶β鏈、琥珀酸脫氫酶、黃素蛋白等. 這些結(jié)果表明線粒體呼吸鏈復(fù)合物的改變與二氯化錳誘導(dǎo)的線粒體機(jī)能障礙相關(guān).

2展望

線粒體蛋白質(zhì)組研究也必須克服一些困難：由于分離技術(shù)和鑒定技術(shù)的局限，低豐度、低分子量蛋白質(zhì)及疏水性蛋白質(zhì)難以鑒定. 數(shù)據(jù)庫(kù)的貧乏，線粒體蛋白質(zhì)組學(xué)還有待于更進(jìn)一步的發(fā)展. 雖然線粒體蛋白組學(xué)在疾病中的應(yīng)用還不是十分廣泛，但是從發(fā)展趨勢(shì)可以看出它的研究是值得期待的. 今后需進(jìn)一步完善：① 線粒體蛋白組數(shù)據(jù)庫(kù)，特別是人類線粒體蛋白組數(shù)據(jù)庫(kù)的完善，以便將來(lái)與病變組織線粒體蛋白質(zhì)表達(dá)譜進(jìn)行比對(duì). 建立一個(gè)詳細(xì)全面的人類線粒體圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)，有意義的線粒體蛋白功能得到確定，將會(huì)成為開(kāi)發(fā)藥物和探索疾病診斷的強(qiáng)大工具. ② 研究細(xì)胞內(nèi)線粒體蛋白的相互作用和轉(zhuǎn)運(yùn). 隨著蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展進(jìn)步，線粒體蛋白質(zhì)組也將得到長(zhǎng)足發(fā)展，因此揭開(kāi)線粒體作用機(jī)制不再是夢(mèng)想，預(yù)防和治療線粒體相關(guān)疾病必將成為現(xiàn)實(shí).

參考文獻(xiàn)

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篇4

關(guān)鍵詞： 大腸癌 蛋白質(zhì)組學(xué) 差異表達(dá)

大腸癌是我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，近年來(lái)發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，尤其是結(jié)腸癌發(fā)病率的增長(zhǎng)速度迅猛。全球大腸癌的發(fā)病率在腫瘤中男性居第4位、女性居第3位，患病率居第2位[1]。早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、早期治療是決定大腸癌患者預(yù)后及生活質(zhì)量的關(guān)鍵。為了深入研究大腸癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制，強(qiáng)化大腸癌的防治效果，筆者采用蛋白質(zhì)組學(xué)雙向凝膠電泳（2-DE）等研究方法，對(duì)比分析正常直腸黏膜、大腸癌原發(fā)灶組織中蛋白質(zhì)的表達(dá)差異，分離、鑒定大腸癌發(fā)生的相關(guān)蛋白，研究其對(duì)大腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，以期為篩選臨床腫瘤標(biāo)志物和治療靶標(biāo)提供依據(jù)。

1.材料與方法

1.1材料

1.1.1標(biāo)本采集。實(shí)驗(yàn)所用標(biāo)本均取自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，國(guó)家重點(diǎn)肛腸科經(jīng)病理確診的本病首診患者共10例，以及經(jīng)病理確診的正常成人直腸黏膜12例。

1.1.2試劑。IPG緩沖液pH3～10、24cm固相化pH梯度干膠條、2D Quant蛋白質(zhì)定量試劑盒、考馬斯亮藍(lán)G-250，購(gòu)自Amershan Pharmacia公司。

1.1.3儀器。IPGphor等電聚焦儀、Ettan DALT Ⅱ垂直電泳槽、Imagescanner掃描儀均為Amersham Biosciences公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1組織蛋白樣品的制備。組織活檢樣本用生理鹽水反復(fù)沖洗，以去除血液及其他污染，稱取適量組織樣品與8倍體積的組織裂解液混合后，用研缽使組織充分研磨裂解，研磨過(guò)程中不斷加入液氮以避免蛋白降解，置于室溫下1小時(shí)，間斷渦旋混勻，然后于12000g、4℃離心1小時(shí)，吸取上清液即為組織的總蛋白質(zhì)。2D Quant Kit定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。

1.2.2二維凝膠電泳。操作步驟主要按照IPGphor等電聚焦系統(tǒng)使用指南進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3凝膠圖像分析。應(yīng)用Imagescanner掃描儀及LabScan掃描軟件掃描考馬斯亮藍(lán)染膠獲取圖像，PDQuest 2-DE軟件比較分析健康人和大腸癌患者組織蛋白二維電泳圖譜的差異，選取表達(dá)水平相差 2倍以上的點(diǎn)作為后續(xù)質(zhì)譜分析的候選蛋白質(zhì)點(diǎn)。

1.2.4質(zhì)譜分析。從膠中切取差異蛋白質(zhì)點(diǎn)于1.5 ml Eppendorf管中，50%乙腈和100 mmol/L碳酸氫銨脫色30 min，乙腈脫水冷凍抽干。加入10 μl TPCK處理的胰蛋白酶（0.1 mg/L）冰上吸脹60 min，37℃酶解12 h，30 μl萃取液（100%乙腈∶5%甲酸1∶1）萃取60 min，重復(fù)萃取1次。將萃取液收集于0.5 ml Eppendorf管，冷凍濃縮至總體積2-5μl。制備好的樣品在MALDI-TOF-MS質(zhì)譜儀中進(jìn)行分析儀上進(jìn)行分析。結(jié)果利用Mascot軟件檢索NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定蛋白質(zhì)。

2.結(jié)果

2.1兩組組織二維電泳圖譜的建立和圖像分析

應(yīng)用2-DE技術(shù)分別分離12例健康人直腸黏膜和10例大腸癌患者癌組織的混合蛋白?？捡R斯亮藍(lán)G-250染色后，得到了健康人和大腸癌患者組織的2-DE圖譜。為了保證結(jié)果的可靠性，在相同的條件下重復(fù)2-DE兩次，獲得兩組的2-DE圖譜各3張，采用PDquest圖像分析軟件對(duì)2-DE圖像進(jìn)行分析。結(jié)果顯示：健康人組織平均蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)為1000±10，大腸癌組織平均蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)為1010±5，匹配率為（93.5±5.0）%。兩種組織樣本共有26個(gè)差異點(diǎn)，其中在大腸癌組織中表達(dá)上調(diào)點(diǎn)11個(gè)，下調(diào)的點(diǎn)15個(gè)。圖1為有代表性的大腸癌組織蛋白質(zhì)的2-DE圖譜。

2.2差異蛋白質(zhì)點(diǎn)的鑒定

從膠中切取較明顯的10個(gè)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)，進(jìn)行MALDI-TOF-MS質(zhì)譜分析。利用Mascot查詢NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，如果Mascot分?jǐn)?shù)>56分（P

3.討論

不同生物學(xué)特性的腫瘤細(xì)胞具有不同的發(fā)生、發(fā)展和特殊性狀，其中蛋白表達(dá)的差異起到了重要作用。腫瘤與正常組織或細(xì)胞的蛋白質(zhì)表達(dá)譜差異分析是腫瘤蛋白質(zhì)組學(xué)研究中應(yīng)用最廣泛和最有效的手段[2，3]。本課題利用蛋白組學(xué)技術(shù)比較了大腸癌組織與正常直腸黏膜，發(fā)現(xiàn)了5種蛋白質(zhì)的表達(dá)水平均發(fā)生了明顯變化，這些差異表達(dá)的蛋白有可能成為早期診斷大腸癌的候選標(biāo)記物。本研究鑒定出的HSP27、Sl00A9和GST-π均可能與大腸癌的發(fā)生有關(guān)，可能作為大腸癌早期診斷的候選新型生物標(biāo)志物及大腸癌治療的靶標(biāo)，但這需要在以后的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步證實(shí)。生物信息學(xué)分析表明，本研究篩選出的5種蛋白與細(xì)胞增殖、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、細(xì)胞周期調(diào)控等密切相關(guān)，可能在大腸癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，而對(duì)這些蛋白的特進(jìn)一步分析研究可為探討大腸癌的分子機(jī)制、尋找大腸癌早期診斷的分子標(biāo)記物提供實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1]Park in DM，Bray F，F(xiàn)erlay J，et al.G lobal cancer statistics[J].CA CancerJ Clin，2005，55（2）：74-108.

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【關(guān)鍵詞】蛋白質(zhì)組學(xué)；農(nóng)業(yè)生物科學(xué)；研究應(yīng)用

一、引言

蛋白質(zhì)組學(xué)是一種用于解決蛋白質(zhì)在現(xiàn)有水平之上，運(yùn)用大規(guī)模轉(zhuǎn)基因的方式發(fā)揮蛋白質(zhì)應(yīng)有的功能。蛋白質(zhì)組學(xué)是基于蛋白質(zhì)功能體系所形成的前所未有的一種中大突破，其通過(guò)利用生化研究的途徑，順利的攻克了這一難關(guān)。隨著我國(guó)社會(huì)主義現(xiàn)代化的飛速發(fā)展，我國(guó)城鄉(xiāng)之間人口流動(dòng)的比率不斷提高，從而促使了我國(guó)從事農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的居民越來(lái)越少，進(jìn)而增加了我國(guó)對(duì)轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物、林業(yè)喬木等農(nóng)業(yè)生物開(kāi)發(fā)的依賴。但是，由于人們對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的認(rèn)識(shí)性不足，帶來(lái)了這些產(chǎn)物在我國(guó)社會(huì)中的普及性程度不夠，并且也帶來(lái)了這一領(lǐng)域發(fā)展的困難。蛋白質(zhì)組學(xué)相關(guān)研究能夠順利的讓我國(guó)人們和科研領(lǐng)域從對(duì)基因?qū)哟?、核酸層次的認(rèn)識(shí)順利的過(guò)度到了直接從蛋白質(zhì)層次對(duì)諸多基因產(chǎn)物的認(rèn)識(shí)。并且隨著我國(guó)乃至世界對(duì)蛋白質(zhì)組學(xué)的深入研究，這一領(lǐng)域在不久的將來(lái)將會(huì)成為生命科學(xué)研究領(lǐng)域的核心，其能夠解決當(dāng)前在農(nóng)業(yè)生物科學(xué)研究領(lǐng)域遇到的諸多難題。因此，作者在本文中主要結(jié)合自身多年從事生命科學(xué)研究領(lǐng)域的經(jīng)驗(yàn)，對(duì)這一追隨時(shí)代潮流的理論進(jìn)行研究，并就其適用的主要領(lǐng)域（農(nóng)業(yè)生物科學(xué)領(lǐng)域）展開(kāi)應(yīng)用研究。

二、蛋白質(zhì)組學(xué)在農(nóng)學(xué)基礎(chǔ)研究領(lǐng)域中的應(yīng)用研究

蛋白質(zhì)組學(xué)在農(nóng)學(xué)基礎(chǔ)的研究領(lǐng)域中主要應(yīng)用于以下幾兩個(gè)方面：（1）農(nóng)作物與微生物之間相互的作用機(jī)理。有關(guān)文獻(xiàn)表面，農(nóng)作物在生長(zhǎng)過(guò)程當(dāng)中會(huì)與微生物的生存之間存在對(duì)資源的競(jìng)爭(zhēng)，其最終的生長(zhǎng)發(fā)育會(huì)隨著微生物存在的現(xiàn)狀進(jìn)行改變。那么，對(duì)于這一事實(shí)也可以用蛋白質(zhì)組學(xué)理論進(jìn)行解釋。產(chǎn)生這一現(xiàn)象的主要原因是由于當(dāng)農(nóng)作物作物遭遇到微生物的共生和寄生，以及遭遇到病菌的侵害的時(shí)候，其就會(huì)改變被侵害部位的蛋白質(zhì)的含量，從而向外界或者是其他未受侵害的組織或者部分傳遞這一信號(hào)，從而引起整個(gè)農(nóng)作物個(gè)體的反應(yīng)機(jī)制；（2）農(nóng)作物的品質(zhì)改良、提升產(chǎn)量問(wèn)題。通過(guò)利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)可以提高農(nóng)作物的產(chǎn)量，還可以改善農(nóng)作物的品質(zhì)。例如，著名生物學(xué)家Natarajan，其對(duì)野生型的黃豆和農(nóng)戶種植型的黃豆，利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)進(jìn)行研究、比較其兩種不同生長(zhǎng)環(huán)境下的黃豆，其內(nèi)部硫氨基酸的含量存在較大區(qū)別，從而證明了提升黃豆蛋白中的硫氨基酸的濃度，能夠極大的改善現(xiàn)有大豆農(nóng)作物產(chǎn)品的品質(zhì)。

三、蛋白質(zhì)組學(xué)在林學(xué)研究研究領(lǐng)域中的應(yīng)用研究

時(shí)至今日，世界范圍已經(jīng)開(kāi)始應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)這門技術(shù)，來(lái)對(duì)林木的生長(zhǎng)、發(fā)育、繁殖，以及當(dāng)林木受到了生物以及非生物的脅迫后產(chǎn)生的反應(yīng)展開(kāi)研究。這些研究為人們?cè)黾恿搜劢纾沟卯?dāng)前人們對(duì)有關(guān)林木生物學(xué)產(chǎn)生了更為深刻的了解。在今天，蛋白質(zhì)組學(xué)已經(jīng)滲透到了農(nóng)學(xué)基礎(chǔ)領(lǐng)域的多個(gè)方面，例如：在林木的遺傳育種領(lǐng)域、林木病蟲害的防止領(lǐng)域等等。通過(guò)對(duì)蛋白質(zhì)組學(xué)的應(yīng)用，解決了以往讓諸多從事這一研究領(lǐng)域科學(xué)家頭疼的問(wèn)題。以下作者將結(jié)合上述幾種應(yīng)用領(lǐng)域進(jìn)行分別應(yīng)用研究：（1）林木的遺傳育種領(lǐng)域。著名生物學(xué)家Huang在其文中建立了具有高分辨率的和高穩(wěn)定性的一種雙向的電泳式的圖譜，并以經(jīng)過(guò)矮化處理過(guò)后的杉木葉片中蛋白質(zhì)為例，運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)其展開(kāi)了有關(guān)研究。其發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)矮化處理的杉木其葉片蛋白質(zhì)的數(shù)量較野生杉木葉片蛋白質(zhì)的數(shù)量更低。（2）關(guān)于林木的逆境應(yīng)答研究。著名生物科學(xué)家Renaut等人，采用情景模擬的方式，為林木設(shè)置逆境的環(huán)境，經(jīng)過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，在擁有六百個(gè)蛋白質(zhì)的植物經(jīng)過(guò)環(huán)境變化，其內(nèi)部蛋白質(zhì)的數(shù)量減少了百分之十，并且這些消失的蛋白質(zhì)主要是與林木的新陳代謝有關(guān)。（3）關(guān)于林木病蟲害領(lǐng)域研究。著名科學(xué)家Fan等人，以毛泡桐、白花泡桐為例，通過(guò)設(shè)置同齡和同方位的產(chǎn)生病蟲害的部位切片，對(duì)這一切片中的蛋白質(zhì)進(jìn)行了單項(xiàng)和雙向兩種方式的電泳分析。其研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這兩種類型的泡桐的病蟲害切片當(dāng)中均找尋不到蛋白多肽這種物質(zhì)，從而他們得出了這一的研究結(jié)論，即：林木的病蟲害與林木中所含的蛋白多肽存在負(fù)相關(guān)的關(guān)系。

四、蛋白質(zhì)組學(xué)在其他農(nóng)業(yè)生物科學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用研究

蛋白質(zhì)組學(xué)還可以應(yīng)用于研究水產(chǎn)業(yè)和畜牧業(yè)的研究，例如：可以利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，研究水產(chǎn)業(yè)和畜牧業(yè)的肉類不同品質(zhì)、不同性狀時(shí)其內(nèi)部所含有的蛋白質(zhì)的數(shù)量，從而判斷哪種元素能夠促進(jìn)蛋白質(zhì)總量的增加，從而改變?nèi)赓|(zhì)和性狀。另外，也可以利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)去研究這些產(chǎn)業(yè)中神經(jīng)組織中蛋白組的問(wèn)題、逆境脅迫的應(yīng)答反應(yīng)，或者是用于其他領(lǐng)域，例如：研究分離和鑒定農(nóng)藥蛋白質(zhì)中所包含的靶分子的結(jié)構(gòu)等等。

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關(guān)鍵詞：蛋白質(zhì)組學(xué)；非生物脅迫；生物脅迫；雙向電泳；質(zhì)譜

中圖分類號(hào)：q946.1；q945.78 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：a 文章編號(hào)：0439-8114（2013）22-5403-06

隨著生命科學(xué)的日益發(fā)展，對(duì)基因功能的研究已不僅僅局限在核酸水平。蛋白質(zhì)是基因功能的執(zhí)行者，是生命現(xiàn)象的直接體現(xiàn)者。要深入了解生命的復(fù)雜活動(dòng)，就需要從蛋白質(zhì)的整體水平上進(jìn)行研究。蛋白質(zhì)組學(xué)是指研究蛋白質(zhì)組的科學(xué)，本質(zhì)上是在大規(guī)模水平上研究蛋白質(zhì)的特征，包括蛋白質(zhì)的表達(dá)水平、翻譯后的修飾、蛋白與蛋白相互作用等，由此獲得蛋白質(zhì)水平上的關(guān)于組織變化、細(xì)胞代謝等過(guò)程的整體而全面的認(rèn)識(shí)[1]。近些年來(lái)，蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)展迅速，并得到了廣泛的應(yīng)用，成為生命科學(xué)研究的核心內(nèi)容之一。

植物在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中會(huì)遭遇高（低）溫、干旱、水澇和高鹽等非生物脅迫以及病原菌侵染和蟲害等生物脅迫。植物感受逆境信號(hào)后，可以通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)抗逆相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而調(diào)整自身的生理狀態(tài)或形態(tài)來(lái)提高對(duì)逆境的耐受能力。在蛋白水平，對(duì)發(fā)生變化的蛋白質(zhì)進(jìn)行定性和定量測(cè)定，探討植物在逆境脅迫條件下的調(diào)控機(jī)制，是研究植物抗逆性的重要手段之一，并已在多種植物的研究中取得了一定的成果。

1 蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)

過(guò)去，許多科學(xué)家都致力于蛋白質(zhì)組的大規(guī)模定性分析，而現(xiàn)在，如何系統(tǒng)地識(shí)別和定量一個(gè)蛋白質(zhì)組則是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的主要目的之一[2]。由于蛋白質(zhì)的濃度在很大程度上影響了其功能的實(shí)現(xiàn)，因此，對(duì)蛋白質(zhì)的相對(duì)和絕對(duì)濃度進(jìn)行測(cè)量也就變得至關(guān)重要。目前，比較成熟的蛋白質(zhì)定量方法主要分為兩類，一類基于傳統(tǒng)雙向凝膠電泳及染色，另一類基于質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)。

1.1 基于凝膠的定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)

雙向電泳（two dimensional electrophoresis，2de）技術(shù)是由o’farrell于20世紀(jì)70年代建立的[3]，具有高分辨率的特點(diǎn)，通常能分辨出1 000～3 000個(gè)蛋白點(diǎn)[4]。該技術(shù)自誕生以來(lái)，一直在不斷改進(jìn)和優(yōu)化。目前，應(yīng)用比較廣泛的雙向電泳技術(shù)主要是雙向熒光差異凝膠電泳（two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis，2d-dige）。但雙向電泳本身也存在著一些弊端：試驗(yàn)重復(fù)性差；對(duì)蛋白質(zhì)的分離受到蛋白豐度、等電點(diǎn)、相對(duì)分子質(zhì)量和疏水性等的限制；自動(dòng)化程度低；操作起來(lái)費(fèi)時(shí)費(fèi)力等，這些都在一定程度上限制了該技術(shù)的應(yīng)用。

1.2 基于質(zhì)譜的定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)

基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)定量技術(shù)可以分為兩大類：標(biāo)記定量技術(shù)（labeling quantitation）和非標(biāo)記定量技術(shù)（label-free quantitation）[2]。此外，標(biāo)記或非標(biāo)記的鳥槍蛋白質(zhì)組學(xué)策略也是基于質(zhì)譜技術(shù)的常用方法。

1.2.1 標(biāo)記定量技術(shù)

1.2.1.1 同位素代謝標(biāo)記法

同位素代謝標(biāo)記以同位素元素或同位素標(biāo)記氨基酸形式摻入到細(xì)胞培養(yǎng)基中，在細(xì)胞生長(zhǎng)代謝過(guò)程中完成蛋白質(zhì)同位素標(biāo)記。此方法的顯著優(yōu)點(diǎn)是蛋白質(zhì)在樣品制備的初期被標(biāo)記，由此減少了試驗(yàn)操作造成的誤差，從而提高了準(zhǔn)確度。目前比較常用的方法包括15n體內(nèi)代謝標(biāo)記和細(xì)胞培養(yǎng)中穩(wěn)定同位素標(biāo)記氨基酸（stable isotope labeling by amino acids in cell culture，silac）方法。

1）15n體內(nèi)代謝標(biāo)記法。采用含有15n（或14n）作為惟一氮源的培養(yǎng)基來(lái)培養(yǎng)植物組織（植株），依靠摻入合成蛋白質(zhì)的15n實(shí)現(xiàn)定量[5]。這項(xiàng)技術(shù)適用于多種蛋白提取物的蛋白質(zhì)定量，包括那些需要進(jìn)行大量純化步驟、蛋白產(chǎn)量易發(fā)生改變的[6]。其優(yōu)勢(shì)還在于可應(yīng)用于水培植物，使得植物對(duì)養(yǎng)分的吸收得到更好的控制。

2）silac方法。依靠在培養(yǎng)介質(zhì)中加入穩(wěn)定同位素標(biāo)記的必需氨基酸（如賴氨酸或精氨酸等）實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)的定量，已經(jīng)廣泛用于高等動(dòng)物細(xì)胞蛋白質(zhì)的鑒定及定量[5]。silac法標(biāo)記效率高、損失??；標(biāo)記誤差低，可靠性高。然而，由于植物細(xì)胞本身可以合成這些

必需氨基酸，導(dǎo)致只有部分蛋白質(zhì)被標(biāo)記。并且，此方法成本較高，導(dǎo)致其在植物蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的應(yīng)用受到了一定的限制。

1.2.1.2 同位素化學(xué)標(biāo)記法

1）同位素親和標(biāo)記法。比較典型且已商業(yè)化的一項(xiàng)技術(shù)是同位素親和標(biāo)記技術(shù)（isotope coded affinity tages，icat）。icat 無(wú)需繁冗的雙向凝膠電泳技術(shù)，標(biāo)記策略靈活多變，可對(duì)低豐度、難溶性蛋白進(jìn)行分析。近些年來(lái)，該技術(shù)與不同的質(zhì)譜技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用得到了廣泛的研究。但icat適用于含半胱氨酸或半胱氨酸存在修飾的蛋白質(zhì)。

2）酶催化18o-同位素標(biāo)記法。酶催化18o-同位素標(biāo)記法是通過(guò)加入h218o，在蛋白酶催化作用下將羧基上的2個(gè)16o替換成18o，從而對(duì)肽段進(jìn)行標(biāo)記。該技術(shù)有以下優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單；標(biāo)記效率高，準(zhǔn)確率高；應(yīng)用范圍廣，可用于多種不同類型的蛋白質(zhì)；可標(biāo)記所有酶解的肽段，使相對(duì)定量所有的蛋白質(zhì)成為可能；反應(yīng)條件溫和、副產(chǎn)物少；便于與磷酸化肽段富集方法聯(lián)用，適于低豐度磷酸化肽段的定量標(biāo)記肽段；在蛋白質(zhì)水解分裂的同時(shí)被標(biāo)記上，避免了人為因素的干擾。但由于標(biāo)記后的蛋白質(zhì)樣品過(guò)于復(fù)雜，該技術(shù)還有待進(jìn)一步的完善。 　3）相對(duì)和絕對(duì)定量同位素標(biāo)記法。相對(duì)和絕對(duì)定量同位素標(biāo)記（isobaric tags for relative and absolute quantitation，itraq）技術(shù)是美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司在 2004 年推出的一項(xiàng)新的體外同位素標(biāo)記技術(shù)[7]。該技術(shù)使用8種（或4種）不同的同位素試劑來(lái)同時(shí)標(biāo)記和比較8種（或4種）不同的蛋白質(zhì)樣品。如今該技術(shù)的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，其優(yōu)越性也逐步在許多生物體和組織研究中得到了證明，已成為目前蛋白質(zhì)組學(xué)定量方法中一個(gè)十分重要的技術(shù)。

itraq技術(shù)有如下特點(diǎn)：①樣本量大?？蓪?duì)多達(dá)4個(gè)樣本同時(shí)相對(duì)量化，大大降低了試驗(yàn)過(guò)程中所引入的技術(shù)誤差；②定性分析結(jié)果可靠。可以同時(shí)給出每一個(gè)組分的相對(duì)分子質(zhì)量和豐富的結(jié)構(gòu)信息；③靈敏度、準(zhǔn)確度高。將離子抑制效應(yīng)、背景噪音和儀器條件等系統(tǒng)誤差的影響降到最小，獲得的變異系數(shù)在9%的范圍；④分離能力強(qiáng)，分析范圍廣。作為標(biāo)記的反應(yīng)不在活細(xì)胞，適合任何類型的蛋白質(zhì)樣品，包括高相對(duì)分子質(zhì)量蛋白質(zhì)、酸性蛋白質(zhì)、堿性蛋白質(zhì)、不溶性蛋白質(zhì)（eg.膜蛋白）等；⑤分析時(shí)間快，自動(dòng)化程度高。

當(dāng)然，itraq標(biāo)記技術(shù)也有自己的局限性。對(duì)全組蛋白質(zhì)而言，它只能對(duì)相對(duì)豐度進(jìn)行比較，因此只能提供相對(duì)的定量；數(shù)據(jù)的復(fù)雜度更高，因此需要開(kāi)發(fā)更多的信息學(xué)工具；高豐度蛋白質(zhì)干涉了低豐度蛋白質(zhì)的檢測(cè)和鑒定；每次試驗(yàn)，研究人員都必須鑒別全部的蛋白質(zhì)組[8]。

1.2.2 非標(biāo)記定量技術(shù) 非標(biāo)記定量法（label-free）是一種新興的蛋白質(zhì)定量方法，包括基于色譜峰面積定量法及利用二級(jí)離子信號(hào)的強(qiáng)度進(jìn)行mrm（多反應(yīng)監(jiān)測(cè)）檢測(cè)等。與標(biāo)記定量法相比，非標(biāo)記定量法不需要花費(fèi)大量時(shí)間準(zhǔn)備同位素化合物，也不需要使用非常昂貴的試劑，但該技術(shù)比較依賴于儀器的狀態(tài)、樣品的復(fù)雜性以及一些未知因素，其靈敏度和精確度都不及標(biāo)記定量法。要得到廣泛的應(yīng)用，非標(biāo)記定量技術(shù)還需要進(jìn)一步的優(yōu)化和改進(jìn)。

1.2.3 鳥槍蛋白質(zhì)組學(xué)策略 鳥槍法首先采用標(biāo)記或非標(biāo)記的方法將蛋白質(zhì)混合物降解成肽段的混合物，利用質(zhì)譜進(jìn)行分析測(cè)序，然后利用計(jì)算機(jī)技術(shù)描繪出肽段在蛋白質(zhì)上的位置圖譜，從而確定該混合物中的蛋白質(zhì)成分。其代表方法是mudpit。

2 蛋白質(zhì)組學(xué)在植物逆境生物學(xué)研究中的應(yīng)用

自然界中有多種非生物和生物因子都會(huì)對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育造成不利影響，嚴(yán)重時(shí)甚至?xí)?dǎo)致植物的死亡。植物對(duì)這些逆境脅迫都有很強(qiáng)的響應(yīng)機(jī)制，可通過(guò)一系列從細(xì)胞到生理水平的應(yīng)答反應(yīng)來(lái)適應(yīng)這些不利的環(huán)境條件。應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究在逆境脅迫下植物蛋白質(zhì)種類及表達(dá)量的變化，將有助于人們從整體和動(dòng)態(tài)的蛋白質(zhì)水平了解脅迫因子的傷害機(jī)制以及植物的適應(yīng)機(jī)制。

2.1 非生物脅迫的植物蛋白質(zhì)組學(xué)研究

2.1.1 溫度脅迫 溫度是影響植物生長(zhǎng)發(fā)育和農(nóng)作物產(chǎn)量的重要環(huán)境因子。目前的研究較多集中于溫度脅迫下差異表達(dá)蛋白質(zhì)的鑒定和植物響應(yīng)高溫、低溫分子機(jī)制的解析。

ganmulla等[9]將24日齡水稻秧苗的葉片分別在5 ℃（12 d）、12 ℃（20 d）的低溫和28 ℃（36 d）、36 ℃（44 d）的高溫環(huán)境下處理3 d，并檢測(cè)其蛋白質(zhì)組變化。采用無(wú)標(biāo)記的鳥槍法，對(duì)每個(gè)處理組的3個(gè)生物

學(xué)重復(fù)進(jìn)行了蛋白質(zhì)定量分析。結(jié)果表明，在一個(gè)或多個(gè)處理組中被鑒定出來(lái)的蛋白，有超過(guò)400個(gè)都對(duì)溫度脅迫進(jìn)行了響應(yīng)。其中，分別有43、126和47個(gè)蛋白專一地出現(xiàn)在了5 ℃（12 d）、12 ℃（20 d）和36 ℃（44 d）處理組中。并且，與其他溫度處理相比， 12 ℃（20 d）處理后的水稻葉片蛋白質(zhì)組發(fā)生的變化更顯著。另外，該試驗(yàn)還鑒定出了20個(gè)新的脅迫響應(yīng)蛋白。

為了檢測(cè)在成熟的硬質(zhì)小麥子粒中熱脅迫對(duì)非醇溶谷蛋白積累所產(chǎn)生的影響，laino等[10]將意大利栽培種svevo進(jìn)行了2個(gè)不同的溫度處理（熱脅迫和對(duì)照）。通過(guò)檢測(cè)非醇溶谷蛋白的2-d模型，鑒定出了在灌漿期受熱脅迫影響的多肽。這項(xiàng)研究共發(fā)現(xiàn)了132個(gè)表達(dá)發(fā)生變化的多肽，其中有47個(gè)（包括hsps和脅迫相關(guān)蛋白）是通過(guò)基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（maldi-tof）和基質(zhì)輔助激光解析電離串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜（maldi-tof-tof-ms）鑒定出來(lái)的。很多熱誘導(dǎo)的多肽被認(rèn)為會(huì)引起敏感植株的反應(yīng)。

2.1.2 水分脅迫 近年來(lái)，研究人員利用蛋白質(zhì)組學(xué)，已鑒定出一些水分脅迫響應(yīng)關(guān)鍵因子，并揭示出植物應(yīng)答水分脅迫所涉及到的多個(gè)代謝通路。

ford等[11]在2011年首次采用鳥槍蛋白質(zhì)組策略研究了小麥（triticum aestivum l.）栽培種在干旱脅迫下的蛋白豐度變化。對(duì)不耐旱種kukri、耐旱種excalibur和耐旱種rac875在溫室中進(jìn)行周期性干旱處理，處理結(jié)束后從葉片中提取蛋白，共鑒定出5 125個(gè)肽段，并分析出1 299個(gè)蛋白。從中選擇了159個(gè)在所有時(shí)間點(diǎn)都有表達(dá)的蛋白用itraq技術(shù)進(jìn)行相對(duì)定量。在不同時(shí)間點(diǎn)，3個(gè)栽培種的蛋白組變化反映了它們對(duì)干旱脅迫的不同生理響應(yīng)。結(jié)果顯示，在脅迫處理前期，excalibur沒(méi)有明顯的蛋白組變化，而rac875的蛋白組發(fā)生了顯著變化。這3個(gè)栽培種的蛋白組變化都與它們的氧化脅迫代謝和活性氧清除能力相一致，表現(xiàn)為超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶的增多以及參與光合作用和卡爾文循環(huán)的蛋白的減少。

祁建民等[12]以鑒定出的耐旱性紅麻品種ga42為材料，在5葉期設(shè)置正常供水與控水比較試驗(yàn)，運(yùn)用雙向電泳分析紅麻在干旱脅迫和正常供水條件下葉片蛋白質(zhì)組的動(dòng)態(tài)變化。在干旱脅迫下出現(xiàn)65個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)點(diǎn)，選擇表達(dá)量明顯上調(diào)的9 個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)，通過(guò)maldi-tof-tof ms分析和數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，鑒定出6個(gè)差異表達(dá)蛋白，分別是2個(gè)核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶或其大亞基、1個(gè)rubisco活化酶、1個(gè)二甲基萘醌甲基轉(zhuǎn)移酶、1個(gè)推測(cè)的胞質(zhì)型谷氨酰胺合成酶以及1個(gè)atp合酶β亞基。試驗(yàn)證明，紅麻ga42表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐旱性與上述6個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)點(diǎn)明顯上調(diào)有關(guān)。 　komatsu等[13]將發(fā)芽2 d的大豆在水澇脅迫下處理2 d，從大豆的根系和下胚軸中提取蛋白質(zhì)。經(jīng)sd-page和cbb染色后，在每張凝膠上得到具有可重復(fù)性的蛋白點(diǎn)約803個(gè)。水澇脅迫引起了21個(gè)蛋白點(diǎn)的表達(dá)量升高，其中有定位/貯存相關(guān)蛋白（11個(gè)）、能量相關(guān)蛋白（3個(gè)）、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白（2個(gè)）、初生代謝相關(guān)蛋白（2個(gè)）、細(xì)胞結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白（1個(gè)）、病害/防御相關(guān)蛋白（1個(gè)）以及轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（1個(gè)）。同時(shí)，7個(gè)蛋白點(diǎn)的表達(dá)量在水澇脅迫處理后降低，包括4個(gè)定位/貯存相關(guān)蛋白和3個(gè)病害/防御相關(guān)蛋白。

2.1.3 鹽脅迫及滲透脅迫 土壤鹽分過(guò)多是影響植物生長(zhǎng)發(fā)育、導(dǎo)致農(nóng)業(yè)減產(chǎn)的主要因素之一。鹽脅迫對(duì)植物的危害主要體現(xiàn)在滲透脅迫和離子脅迫等方面。

barkla等[14]對(duì)植物質(zhì)膜在鹽脅迫下的作用進(jìn)行了研究，鑒定出了參與調(diào)控液泡中na+隔離的蛋白質(zhì)。對(duì)鹽脅迫處理的冰葉日中花和對(duì)照進(jìn)行的雙向差異凝膠電泳分析表明，質(zhì)膜包括質(zhì)膜h+-atpase 和v-atpase的亞基，都與醛縮酶和烯醇酶這兩個(gè)糖降解酶相關(guān)。利用免疫共沉淀證實(shí)糖降解酶與v-atpase的b亞基vha-b存在相互作用。體外試驗(yàn)證明，醛縮酶可以通過(guò)吸引atp來(lái)激活v-atpase的活性。采用擬南芥烯醇酶突變體進(jìn)行生物學(xué)功能驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)這些突變體對(duì)鹽脅迫敏感，并且在其質(zhì)膜中，醛縮酶激活v-atpase水解活性的能力減弱。糖降解蛋白與質(zhì)膜的這些聯(lián)系直接上調(diào)了質(zhì)子泵的活性。

bandehagh等[15]對(duì)油菜鹽脅迫響應(yīng)機(jī)制進(jìn)行了研究，分析了耐鹽的油菜栽培種hyola 308和不耐鹽的栽培種sarigol的第二片新葉和第三片新葉中蛋白的表達(dá)。對(duì)處于營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期的植株分別進(jìn)行0、175和350 mmol/l的nacl處理。與第二片新葉相比，第三片新葉中的na含量較高且生長(zhǎng)勢(shì)較弱。不耐鹽植株中na的積累比耐鹽

植株中更加顯著。2-de凝膠檢測(cè)出了900多個(gè)蛋白點(diǎn)，其中有44個(gè)和31個(gè)蛋白的表達(dá)量分別在耐鹽和不耐鹽的基因型中發(fā)生了變化。聚類分析發(fā)現(xiàn)，根據(jù)第二片新葉的鹽含量可明顯區(qū)分出這兩種不同的基因型。ms分析鑒定出了46個(gè)蛋白，包括參與氧脅迫響應(yīng)、能量供應(yīng)、電子轉(zhuǎn)運(yùn)、翻譯和光合作用的蛋白。

skirycz等[16]研究了擬南芥葉片在緩和而持久的滲透脅迫下的適應(yīng)能力。通過(guò)15n代謝標(biāo)記法分析了蛋白變化。結(jié)果表明，質(zhì)體的atpase、卡爾文循環(huán)和光呼吸都被下調(diào)了，但線粒體的atp系統(tǒng)被上調(diào)了。這說(shuō)明線粒體在植物遭受水分脅迫時(shí)對(duì)保護(hù)質(zhì)體起到很重要的作用。此外，脅迫下的轉(zhuǎn)錄組和蛋白組數(shù)據(jù)非常一致，但很多蛋白與蛋白合成和降解相關(guān)，推測(cè)其受到了轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控。

張恒[17]用不同濃度的na2co3對(duì)星星草（puccinellia tenuiflora）進(jìn)行處理，研究了其在鹽脅迫下的應(yīng)答機(jī)制。應(yīng)用itraq標(biāo)記法對(duì)蛋白質(zhì)組進(jìn)行定量分析，發(fā)現(xiàn)葉綠體中68種na2co3應(yīng)答蛋白質(zhì)，它們主要參與捕光復(fù)合體、光系統(tǒng)ⅱ、光合電子傳遞鏈和光系統(tǒng)ⅰ的形成、能量代謝、卡爾文循環(huán)、光合色素代謝、基礎(chǔ)代謝、脅迫防御、轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)合成與命運(yùn)，以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等過(guò)程。

2.1.4 營(yíng)養(yǎng)脅迫 為了解水稻對(duì)磷缺乏的適應(yīng)性，torabi等[18]分析了親本株系nipponbare與其近等基因系nil6-4（在第12條染色體上攜帶一個(gè)主要磷吸收的qtl）的根系在1和100 mmol/l磷濃度下生長(zhǎng)的蛋白質(zhì)組。2-de檢測(cè)到669個(gè)蛋白點(diǎn)，兩種基因型中有32個(gè)蛋白有明顯差異。其中，兩種基因型在脅迫條件下有17個(gè)蛋白表現(xiàn)不同。質(zhì)譜鑒定出參與適應(yīng)磷缺乏途徑的26個(gè)蛋白，包括活性氧清除劑、檸檬酸循環(huán)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和植物防御反應(yīng)蛋白，還有一些未知功能蛋白。這說(shuō)明不僅有一條控制適應(yīng)磷缺乏能力的信號(hào)途徑，可能還存在著不同途徑間的相互作用。

visioli等[19]對(duì)黑楊的一個(gè)高度抗鈣脅迫的未定種進(jìn)行了蛋白組變化分析。運(yùn)用2-d液相色譜技術(shù)分離出126個(gè)蛋白。其中，有20個(gè)蛋白被鑒定為受到了鈣脅迫的影響，并通過(guò)maldi-tof進(jìn)行了指紋圖譜分析。在脅迫處理的樣品中，豐度較高的蛋白集中在葉綠體和線粒體中，說(shuō)明這兩個(gè)細(xì)胞器在植物對(duì)鈣脅迫的響應(yīng)中扮演了重要角色。

李坤朋[20]對(duì)兩種不同基因型的玉米在富磷或缺磷條件下的蛋白質(zhì)組變化進(jìn)行了雙向凝膠電泳分析，分別鑒定出79個(gè)和108個(gè)差異表達(dá)蛋白，功能解析表明，這些蛋白可能在調(diào)控玉米根系形態(tài)發(fā)育、細(xì)胞周期以及感知環(huán)境磷濃度變化等方面發(fā)揮了重要作用。

2.1.5 其他非生物脅迫 其他非生物脅迫如臭氧、重金屬、機(jī)械損傷等對(duì)植物的影響，也在蛋白質(zhì)組水平上取得了一定的進(jìn)展。

肖清鐵等[21]以抗鎘水稻品種pi312777和鎘敏感水稻品種ir24為材料，在不同鎘離子濃度的條件下水培處理7 d。與對(duì)照相比，不同濃度鎘脅迫下，pi312777中熱激蛋白、谷胱甘肽還原酶、蛋白酶體α亞基6型、果糖-1，6-二磷酸醛縮酶、硫氧還蛋白和dna重組修復(fù)蛋白均上調(diào)表達(dá)；而ir24中熱激蛋白、谷胱甘肽還原酶、蛋白酶體α亞基6型的表達(dá)無(wú)顯著差異，但果糖-1，6-二磷酸醛縮酶和硫氧還蛋白表達(dá)下調(diào)。此外，dna重組修復(fù)蛋白僅在鎘脅迫的pi312777葉片中表達(dá)。這些差異表達(dá)的蛋白質(zhì)很可能是水稻pi312777比ir24具有更強(qiáng)鎘抗性的生物學(xué)基礎(chǔ)。

fuhrs等[22]研究了豇豆蛋白質(zhì)組對(duì)錳脅迫的響應(yīng)，發(fā)現(xiàn)錳脅迫后豇豆葉綠體中與co2固定和光合作用相關(guān)的蛋白豐度下降，說(shuō)明錳脅迫對(duì)豇豆的能量代謝產(chǎn)生抑制作用。

樂(lè)寅婷等[23]對(duì)比了油菜（brassica napus cv. westar）在機(jī)械損傷前后可溶性總蛋白的含量變化，發(fā)現(xiàn)損傷后蛋白表達(dá)量增高。雙向凝膠電泳分析表明有8個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)發(fā)生了明顯的上調(diào)或下調(diào)，質(zhì)譜鑒定出rubisco小亞基前體、果糖-1，6-二磷酸醛縮酶和糞卟啉-3-氧化酶，這些蛋白質(zhì)可能在油菜葉片應(yīng)答機(jī)械損傷過(guò)程中起關(guān)鍵作用。 　ahsan等[24]用雙向凝膠電泳法檢測(cè)了在o3脅迫下大豆中蛋白質(zhì)的變化，分別在葉片和葉綠體中鑒定出20個(gè)和32個(gè)差異表達(dá)蛋白。其中，參與光合作用（包括光系統(tǒng)ⅰ/ⅱ和碳素同化）的蛋白都在脅迫后表達(dá)量降低，而與抗氧化劑系統(tǒng)和碳代謝相關(guān)的蛋白表達(dá)量增高。參與糖代謝的酶活性在脅迫后增強(qiáng)，淀粉減少而蔗糖增加。試驗(yàn)表明在光合系統(tǒng)經(jīng)受o3脅迫時(shí)，可能通過(guò)淀粉降解為三羧酸的循環(huán)功能，使碳分配受到了影響。

2.2 生物脅迫的植物蛋白質(zhì)組

學(xué)研究

2.2.1 病原菌侵染 病原菌侵染時(shí)植物局部會(huì)發(fā)生壞死并誘導(dǎo)產(chǎn)生一些抗病蛋白質(zhì)。

maserti等[25]以柑橘屬（citrus l.）的果樹為材料，對(duì)二斑葉螨（tetranychus urticae）侵染后和茉莉酸甲酯處理后的葉片進(jìn)行了蛋白表達(dá)差異分析，分別檢測(cè)出了110個(gè)和67個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)。應(yīng)用液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)鑒定出50個(gè)蛋白，大部分都屬于光合和代謝相關(guān)蛋白。其中有5個(gè)與氧脅迫相關(guān)的酶，包括磷脂谷胱甘肽過(guò)氧化物酶、1個(gè)鹽脅迫相關(guān)蛋白、抗壞血酸過(guò)氧化物酶和錳超氧化物歧化酶。有7個(gè)防御相關(guān)蛋白，包括與發(fā)病相關(guān)的酸性幾丁質(zhì)酶、蛋白酶抑制劑類奇蛋白和低密度脂蛋白等。

采用雙向電泳聯(lián)用 moldi-tof-tof 質(zhì)譜技術(shù)，張曉婷等[26]對(duì)水稻感病品種武育粳3號(hào)和抗病品種kt95-418感染水稻條紋病毒（rice stripe virus，rsv）前后的葉片進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析。結(jié)果顯示，rsv基因組編碼的病害特異蛋白（disease specific protein， dsp）在武育粳3號(hào)中的積累量明顯高于kt95-418中。另外還鑒定出其他25個(gè)蛋白，包括rsv ns2蛋白，寄主中與光合作用、細(xì)胞氧化還原狀態(tài)和離子平衡狀態(tài)及蛋白的合成、轉(zhuǎn)運(yùn)與翻譯后修飾等相關(guān)的蛋白。

鐘云[27]選用廣東主栽砧木資源——江西紅橘的根系為材料，運(yùn)用itraq技術(shù)，分析了其接種黃龍病病原后第50天的根系蛋白。鑒定得到差異顯著蛋白78個(gè)。差異蛋白主要參與生物代謝、防御反應(yīng)、抗氧化、轉(zhuǎn)運(yùn)和幾丁質(zhì)代謝等。與轉(zhuǎn)錄組關(guān)聯(lián)性強(qiáng)的差異蛋白有36個(gè)，其中半數(shù)與抗?。妫┫嚓P(guān)。植株感病后韌皮部篩管閉塞有關(guān)的篩管阻塞蛋白上調(diào)了1.67倍，這與防御黃龍病病原有關(guān)。另外，枯草桿菌樣蛋白酶表達(dá)是對(duì)照的282.09倍，說(shuō)明該酶參與了黃龍病病原菌的抵御及根尖分生區(qū)的保護(hù)。

2.2.2 蟲害 魏哲[28]利用itraq技術(shù)篩選了水稻抗褐飛虱相關(guān)蛋白質(zhì)。在褐飛虱取食96 h后的水稻葉鞘中，發(fā)現(xiàn)多種蛋白質(zhì)表達(dá)量發(fā)生了顯著變化。這些蛋白包括3個(gè)ja合成蛋白質(zhì)（alpah-dox、aos和aoc），7個(gè)氧脅迫應(yīng)答蛋白（cata、apx2和5個(gè)poxs），3個(gè)β-葡聚糖酶（gnsl、gns4和gns5），3個(gè)蛋白激酶（crks、crk6和atypicalrlk），1個(gè)蛋白網(wǎng)格蛋白，1個(gè)甘氨酸分解系統(tǒng)h蛋白，5個(gè)光合作用相關(guān)蛋白和4個(gè)水通道蛋白。其中aoc、cata、3個(gè)poxs、gnsl、gns5、3個(gè)蛋白激酶和網(wǎng)格蛋白更多地在易感性水稻株系中被誘導(dǎo)。

由于自然環(huán)境下植物時(shí)常遭遇多重逆境，因此，目前有不少針對(duì)植物逆境蛋白質(zhì)組學(xué)的工作已不僅僅局限于單一脅迫，而是將相關(guān)性較高的幾種脅迫進(jìn)行整合研究。zhang等[29]對(duì)云南假虎刺（carissa spinarum）同時(shí)進(jìn)行了42 ℃高溫和干旱處理。在處理期和恢復(fù)期設(shè)置4個(gè)不同的時(shí)間點(diǎn)取葉片進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)49個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)的表達(dá)量發(fā)生了變化。用ms和2-d凝膠法鑒定出30個(gè)蛋白，這些蛋白包括hsp、光合成相關(guān)蛋白、rna加工蛋白以及參與代謝機(jī)制和能量生產(chǎn)的蛋白。evers等[30]對(duì)馬鈴薯分別進(jìn)行了冷脅迫和鹽脅迫處理，并在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白質(zhì)組水平都進(jìn)行了分析和研究。發(fā)現(xiàn)響應(yīng)鹽脅迫和冷脅迫的基因和蛋白有一致也有不同。在蛋白質(zhì)組水平，大部分鑒定出的蛋白都在脅迫下表達(dá)增強(qiáng)了。大多數(shù)光合成相關(guān)蛋白的豐度在兩種脅迫下都降低了。

3 展望

綜上所述，作為后基因時(shí)代的一個(gè)重要研究手段，蛋白質(zhì)組學(xué)已經(jīng)在植物抗逆研究中廣泛開(kāi)展，獲得了豐碩的成果，對(duì)傳統(tǒng)的植物生理學(xué)及功能基因組學(xué)研究進(jìn)行了補(bǔ)充。然而，植物對(duì)環(huán)境脅迫的響應(yīng)是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程，人們對(duì)植物在逆境下產(chǎn)生的復(fù)雜的生物學(xué)反應(yīng)都還知之甚少，在這方面的研究還處于初步階段。隨著越來(lái)越多植物全基因組測(cè)序的完成、est數(shù)據(jù)庫(kù)的日益豐富，以及研究手段的不斷改進(jìn)，相信將會(huì)有更多的與抗性相關(guān)的基因和蛋白被挖掘，更全面地揭示植物抗逆性的本質(zhì)，為植物抗脅迫品種的選擇和培育奠定基礎(chǔ)。

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篇7

中藥歸經(jīng)是用來(lái)表示藥物作用定位的藥性理論。歸經(jīng)理論源于《內(nèi)經(jīng)》，成于金元時(shí)代，再經(jīng)后人的不斷補(bǔ)充和發(fā)展，至明清時(shí)代已發(fā)展成系統(tǒng)理論，成為中藥理論的重要組成部分之一，并用來(lái)指導(dǎo)臨床用藥。

目前對(duì)中藥歸經(jīng)理論的現(xiàn)代研究處于停滯狀態(tài)。由于至今對(duì)歸經(jīng)理論的認(rèn)識(shí)不盡一致，無(wú)統(tǒng)一規(guī)范的客觀判斷標(biāo)準(zhǔn)，加之受到實(shí)驗(yàn)技術(shù)的限制，所以為從現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)方法來(lái)探求歸經(jīng)的本質(zhì)帶來(lái)了很大的困難。筆者在回顧和總結(jié)分析了中藥歸經(jīng)理論研究方法的現(xiàn)狀后，提出了新的研究思路。

1 中藥歸經(jīng)理論研究方法的現(xiàn)狀

1.1 以藥理作用來(lái)認(rèn)識(shí)藥物的歸經(jīng)

有人用數(shù)理統(tǒng)計(jì)分析法分析其藥物作用與歸經(jīng)之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)中藥的歸經(jīng)與它的藥理作用存在一定的相互關(guān)系[1-2]。

1.2 以有效成分來(lái)探索藥物的歸經(jīng)

利用有效成分探索中藥歸經(jīng)，應(yīng)用較多的是借助同位素示蹤和放射性自顯影來(lái)觀察中藥中的某種活性成分在體內(nèi)臟器的分布特點(diǎn)，以此說(shuō)明中藥活性成分的體內(nèi)分布與中藥歸經(jīng)的關(guān)系[3-4]。根據(jù)這種研究的結(jié)果來(lái)推論，中藥歸經(jīng)的實(shí)質(zhì)是指藥物活性成分在體內(nèi)某些臟器的高濃度分布。但以成分的臟器分布說(shuō)明歸經(jīng)的實(shí)質(zhì)則混淆了中醫(yī)臟腑與解剖臟器在概念與內(nèi)容上的差別，同時(shí)活性成分分布較多的器官，不一定就是該藥作用最明顯的靶器官。但作為一種新的研究方法，值得進(jìn)一步探索。

1.3 用中藥微量元素研究藥物的歸經(jīng)

微量元素分析法是通過(guò)剖析中藥中某些特異性元素的濃度，并結(jié)合這些微量元素在人體臟腑組織中的分布特點(diǎn)，來(lái)實(shí)現(xiàn)“歸經(jīng)”，從而發(fā)揮療效，以推測(cè)微量元素是中藥歸經(jīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)[5-7]。

1.4 從受體學(xué)說(shuō)判斷藥物的歸經(jīng)受體為首先與藥物結(jié)合并能傳遞信息、引起效應(yīng)的細(xì)胞成分，是存在于細(xì)胞膜上或胞漿內(nèi)的大分子蛋白質(zhì)。最初由Langleg[8]用來(lái)描述細(xì)胞上可與藥物和其它化學(xué)信使物質(zhì)結(jié)合并介導(dǎo)效應(yīng)的化學(xué)成分。有人從分子藥理的角度理解，認(rèn)為歸經(jīng)理論可以從現(xiàn)代的受體學(xué)說(shuō)來(lái)認(rèn)識(shí)[9]。葉氏[10]也認(rèn)為，歸經(jīng)與受體學(xué)說(shuō)在強(qiáng)調(diào)藥物對(duì)人體的特殊選擇方面是一致的。只是歸經(jīng)主要從藥物特性的角度出發(fā)，說(shuō)明它對(duì)臟腑經(jīng)絡(luò)具有選擇性的性能；而受體學(xué)說(shuō)則是從人體組織器官的角度出發(fā)，說(shuō)明它對(duì)藥物具有特殊的敏感作用。這兩種認(rèn)識(shí)方法可謂“異曲同工”。

1.5 用環(huán)核苷酸檢測(cè)法認(rèn)識(shí)藥物的歸經(jīng)

鄭氏[11]報(bào)道，環(huán)磷酸腺苷(cAMP)、環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)是細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)代謝的重要物質(zhì)，兩者具有相互拮抗、相互制約的生物學(xué)效應(yīng)。正常情況下，二者必需維持一定的比例，若比例發(fā)生改變(偏高或降低)就會(huì)引起機(jī)體功能失調(diào)而導(dǎo)致疾病，這與中醫(yī)的陰陽(yáng)學(xué)說(shuō)非常相似。有人用五味子、魚腥草、漢防己3味藥的水煎劑分別給大白鼠灌胃后，用放射免疫測(cè)定技術(shù)測(cè)定動(dòng)物腦、肺、心、肝、脾、胃、腎、膀胱8個(gè)臟器組織中cAMP、cGMP的水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，每一種藥物對(duì)不同臟器組織中cAMP、cGMP水平的影響是不一樣的。這表明cAMP、cGMP的濃度變化能在一定程度反映藥物對(duì)某臟器組織的選擇性作用。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析還發(fā)現(xiàn)，cAMP、cGMP濃度以及cAMP/cGMP值有顯著變化者之相關(guān)臟器，與各藥歸經(jīng)的關(guān)系非常密切[12]。

最近，王氏[13]將麻黃、丹參、葛根、大黃給動(dòng)物分別灌胃，通過(guò)測(cè)定動(dòng)物心臟、肝臟等10種組織臟器中環(huán)核苷酸水平的變化，觀察比較中藥對(duì)組織選擇性的影響。結(jié)果顯示，給動(dòng)物連續(xù)灌服麻黃等中藥后，動(dòng)物各組織臟器環(huán)核苷酸含量明顯不同；在所測(cè)定的10種組織中，有9種組織受到麻黃的明顯影響而出現(xiàn)cAMP/cGMP比值顯著升高或者降低；而受丹參影響的組織僅有3種；葛根和大黃對(duì)組織環(huán)核苷酸的影響介于兩者之間。

2 目前研究方法的可取之處與不足之處

綜觀以上各種研究和實(shí)驗(yàn)方法，其思路可概括為兩大類：一是根據(jù)中藥有效成分在體內(nèi)的分布及其作用部位研究中藥的歸經(jīng)，主要從歸經(jīng)與作用部位、歸經(jīng)與有效成分、歸經(jīng)與微量元素、歸經(jīng)與體內(nèi)代謝等方面著手，運(yùn)用同位素示蹤、放射自顯影、微量元素分析等方法進(jìn)行研究；二是根據(jù)藥理效應(yīng)，選定某些特異性的藥理觀察指標(biāo)研究中藥的歸經(jīng)，主要從歸經(jīng)與藥理藥效、歸經(jīng)與受體、歸經(jīng)與環(huán)核苷酸等方面著手進(jìn)行。這些研究方法和思路各有所長(zhǎng)，有可取之處，但也有不足之處。

2.1 可取之處

在這些方法中，取各組織臟器作為觀察材料是可取的，因?yàn)闅w經(jīng)的“經(jīng)”并非單純的經(jīng)絡(luò)或經(jīng)脈之意，而是帶有藥性理論特色的方向、部位的概念，是部位和功能的綜合。正是由于大家知道中醫(yī)的臟腑不同于解剖學(xué)上的臟器，所以才選擇各組織臟器作為觀察對(duì)象，去尋找藥物發(fā)揮主要作用的部位，因?yàn)樗幬锉粰C(jī)體吸收后，總要落實(shí)到相關(guān)的組織臟器才能發(fā)揮其藥理作用。

2.2 不足之處

已知藥物有效成分分布得較多的臟器，不一定就是作用最明顯的靶器官，故僅從分布難以闡明藥物發(fā)揮療效的部位。

所檢測(cè)的藥物是主要活性成分，但不是唯一的活性成分，其分布不能代表所有活性成分的分布。

中藥歸經(jīng)是從疾病對(duì)藥的治療反應(yīng)中總結(jié)出來(lái)的，而大多實(shí)驗(yàn)所用都是生理狀態(tài)下的動(dòng)物，這就不能準(zhǔn)確地反映藥物在病理狀態(tài)動(dòng)物體內(nèi)的作用過(guò)程。

最重要的問(wèn)題是有些實(shí)驗(yàn)方法有悖于中醫(yī)的歸經(jīng)理論。中醫(yī)傳統(tǒng)理論認(rèn)為：一種藥物主要對(duì)某一經(jīng)或某幾經(jīng)發(fā)生明顯作用，而對(duì)其它經(jīng)作用較小，甚至沒(méi)有作用，是為歸經(jīng)；根據(jù)藥物在機(jī)體產(chǎn)生效應(yīng)的部位各有偏重，將其歸納總結(jié)，使之系統(tǒng)化，便形成歸經(jīng)理論。

很明顯，這里講的應(yīng)是藥物對(duì)機(jī)體產(chǎn)生的效應(yīng)而不是藥物的分布。目前的研究方法大都是從觀察藥物有效成分的分布著手。從歸經(jīng)理論的定義來(lái)看，應(yīng)從藥效學(xué)觀點(diǎn)出發(fā)觀察藥物的歸經(jīng)問(wèn)題才符合中醫(yī)歸經(jīng)理論。在這一點(diǎn)上，其實(shí)人們?cè)缫颜J(rèn)識(shí)到了，只是由于研究技術(shù)的限制，即使目前有人從藥效反應(yīng)來(lái)研究藥物歸經(jīng)問(wèn)題，也只能是觀察幾個(gè)功能指標(biāo)，而不可能觀察藥物對(duì)機(jī)體產(chǎn)生的全部效應(yīng)。

3 新的研究思路與方法

如何做到全面地觀察中藥對(duì)機(jī)體各部位產(chǎn)生的效應(yīng)，并從中發(fā)現(xiàn)潛在的規(guī)律，從而闡明歸經(jīng)理論的科學(xué)內(nèi)涵是中藥歸經(jīng)理論研究必須要解決的問(wèn)題。在回顧和總結(jié)分析他人所做的有關(guān)研究工作之后，根據(jù)中藥作用機(jī)制的特點(diǎn)和歸經(jīng)的定義，筆者提出一個(gè)假說(shuō)，并根據(jù)這一假說(shuō)，結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)，設(shè)計(jì)了新的研究方案，使較全面地觀察藥物對(duì)機(jī)體產(chǎn)生的效應(yīng)成為可能。

3.1 中藥的作用特點(diǎn)決定其效應(yīng)可能發(fā)生在機(jī)體任何組織臟器中

由于中藥成分復(fù)雜，單味藥材就是一個(gè)化學(xué)分子庫(kù)，雖然不是所有化學(xué)成分都是有效成分，但在發(fā)揮作用過(guò)程中是一個(gè)涉及多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的作用過(guò)程，因而其效應(yīng)可能發(fā)生在機(jī)體任何組織臟器中，所不同的是在有的組織臟器中其效應(yīng)較強(qiáng)，有的較弱。

3.2 其藥效最終作用結(jié)果是影響機(jī)體蛋白質(zhì)表達(dá)，且效應(yīng)越強(qiáng)，蛋白質(zhì)表達(dá)變化越大

從中藥治療疾病的機(jī)理來(lái)看，中藥治療疾病不是單純強(qiáng)調(diào)以藥物去直接對(duì)抗致病因子，重點(diǎn)在于調(diào)整機(jī)體功能狀態(tài)，發(fā)揮機(jī)體抗病能力。中藥有效部位或有效成分進(jìn)入人體發(fā)揮作用，必然會(huì)引起從遺傳信息到整體功能實(shí)現(xiàn)中的分子、細(xì)胞、器官、整體多個(gè)層面的結(jié)構(gòu)與功能狀態(tài)的改變，調(diào)節(jié)這些層面的結(jié)構(gòu)與功能的本質(zhì)是基因，其藥效最終作用結(jié)果是影響機(jī)體蛋白質(zhì)表達(dá)，因此藥物對(duì)機(jī)體產(chǎn)生的效應(yīng)能從蛋白質(zhì)表達(dá)的變化反映出來(lái)，藥物對(duì)機(jī)體某組織臟器產(chǎn)生的效應(yīng)越強(qiáng)，其蛋白質(zhì)表達(dá)應(yīng)變化越大。

3.3 根據(jù)中藥作用機(jī)制的特點(diǎn)和歸經(jīng)的定義，提出假說(shuō)

由此，根據(jù)歸經(jīng)的定義和中藥作用機(jī)制的特點(diǎn)，我們提出假說(shuō)：歸某經(jīng)的藥物對(duì)機(jī)體產(chǎn)生明顯效應(yīng)的組織臟器應(yīng)當(dāng)具有一定的共性，其效應(yīng)的強(qiáng)度與該組織臟器蛋白質(zhì)表達(dá)差異的數(shù)量有關(guān)，即效應(yīng)越強(qiáng)，蛋白質(zhì)表達(dá)差異的數(shù)量越多，反之亦然。

3.4 蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)的出現(xiàn)，使驗(yàn)證這一假說(shuō)成為可能

蛋白質(zhì)組學(xué)是一門對(duì)某一生物或細(xì)胞在各種不同環(huán)境條件下表達(dá)的所有蛋白質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析的科學(xué)。蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)以其特有的思想方法和技術(shù)手段在解決生物學(xué)重大問(wèn)題上已顯示出其強(qiáng)大的威力。全世界的科學(xué)家正應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)來(lái)解決用傳統(tǒng)方法所不能解決的問(wèn)題[14]。同樣，將蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)運(yùn)用到藥物歸經(jīng)理論研究中，可能會(huì)發(fā)現(xiàn)歸經(jīng)的潛在規(guī)律和本質(zhì)，從而對(duì)中藥歸經(jīng)理論的研究帶來(lái)重大的突破。蛋白質(zhì)組學(xué)集生物技術(shù)、分析技術(shù)、信息技術(shù)和材料技術(shù)等的精華，采用大規(guī)模、高通量、高速度的技術(shù)手段，通過(guò)研究基因所表達(dá)的所有蛋白質(zhì)表達(dá)譜，可以較全面地觀察到機(jī)體對(duì)藥物作用產(chǎn)生的蛋白質(zhì)表達(dá)差異，從而為從藥效學(xué)觀點(diǎn)出發(fā)研究藥物歸經(jīng)的實(shí)質(zhì)與內(nèi)涵找到了一個(gè)極好的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。

4 根據(jù)假說(shuō)，制定研究方法

根據(jù)假說(shuō)，利用蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)，我們只要觀察藥物對(duì)機(jī)體作用后各組織臟器蛋白質(zhì)表達(dá)差異變化的程度，即可推斷出該藥物對(duì)機(jī)體組織臟器產(chǎn)生效應(yīng)強(qiáng)度的大小。具有相同歸經(jīng)的藥物對(duì)機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)效應(yīng)的那些組織臟器就必然有一定的共性，而產(chǎn)生效應(yīng)強(qiáng)度較大的那些組織臟器就應(yīng)與該藥物所歸經(jīng)絡(luò)有關(guān)。

根據(jù)各味中藥的歸經(jīng)情況，我們可以有兩種研究方法，這兩種方法各有優(yōu)點(diǎn)與缺陷。

4.1 用正常動(dòng)物為實(shí)驗(yàn)觀察對(duì)象

用正常動(dòng)物為實(shí)驗(yàn)觀察對(duì)象，所觀察的中藥可不考慮它的作用與藥性，首先選取那些歸單一經(jīng)絡(luò)的藥物，如青葙子、密蒙花、赤芍、月季花、茜草等單歸肝經(jīng)的藥物，浮萍、魚腥草、掛金燈、馬勃、蒼耳子等單歸肺經(jīng)的藥物，仙茅、巴戟天、海狗腎、陽(yáng)起石、葫蘆巴、蛇床子等單歸腎經(jīng)的藥物作為觀察對(duì)象。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是所觀察的藥物歸經(jīng)單一，便于找出其內(nèi)在的規(guī)律。此方法的缺陷是用正常動(dòng)物為實(shí)驗(yàn)觀察對(duì)象，與用病理狀態(tài)下的動(dòng)物相比可能有所差距。

4.2 以中醫(yī)證的動(dòng)物模型為實(shí)驗(yàn)觀察對(duì)象，觀察中藥在病理狀態(tài)動(dòng)物體內(nèi)的作用過(guò)程

這種方法雖然能準(zhǔn)確地反映藥物在病理狀態(tài)動(dòng)物體內(nèi)的作用過(guò)程，但由于作用相同的藥物所歸經(jīng)絡(luò)過(guò)于分散，只有為數(shù)不多的幾類藥物中存在5味以上歸相同經(jīng)絡(luò)的藥物，例如，平肝熄風(fēng)類藥中羚羊角、石決明、天麻、白蒺藜、貝齒、全蝎和蜈蚣等7味歸肝經(jīng)，祛風(fēng)濕類藥中豨薟草、海桐皮、石楠葉、松節(jié)、五加皮和千年健等6味歸肝、腎兩經(jīng)，澤蘭、荊三棱、蓬莪術(shù)、馬鞭草、延胡索、姜黃等6味歸脾、肝兩經(jīng)，且這幾類藥物所治療的相應(yīng)證候動(dòng)物模型也不易制造，因此，這種方法也有一定的局限性。

以上方法無(wú)論選用哪一種，所觀察的具有相同歸經(jīng)的藥物至少選取5味。每味藥給予一組動(dòng)物，然后取每只動(dòng)物的肺臟、腎臟、肝臟、脾臟、胃、心臟、、大腸、小腸以及腦等組織臟器，提取蛋白質(zhì)做雙向凝膠電泳。其蛋白質(zhì)表達(dá)圖譜與給水對(duì)照組的各個(gè)相應(yīng)組織臟器蛋白質(zhì)表達(dá)圖譜相比較，找出表達(dá)差異的蛋白質(zhì)。然后，以表達(dá)差異蛋白質(zhì)數(shù)量的多少排列各組織臟器，最后看給予歸相同經(jīng)絡(luò)幾味藥的動(dòng)物各組織臟器的排列順序是否一致，而給予不同歸經(jīng)藥物的動(dòng)物各組織臟器的排列順序是否不一致。如果能得到上述結(jié)果的話，那么我們就可能找到了歸經(jīng)理論的內(nèi)在規(guī)律和其科學(xué)內(nèi)涵。同時(shí)，我們也可得出排列在前面的幾種組織臟器與所歸的經(jīng)絡(luò)有密切關(guān)系的結(jié)論，這也可為中醫(yī)有關(guān)經(jīng)絡(luò)的實(shí)質(zhì)研究提供客觀依據(jù)。

當(dāng)然，我們也可能得不到這樣的結(jié)果，這無(wú)非有兩種可能：一種是假說(shuō)本身不符合歸經(jīng)理論的真實(shí)客觀情況，因此得不到預(yù)期的結(jié)果；二是假說(shuō)正確，只是由于根據(jù)臨床經(jīng)驗(yàn)得來(lái)的各味藥物的歸經(jīng)所屬還不夠精確客觀，因而得不到預(yù)期的結(jié)果。

在目前中藥歸經(jīng)理論研究停滯不前的狀況下，迫切需要有新的研究思路與方法出現(xiàn)。此方法的思路與設(shè)計(jì)更加符合歸經(jīng)理論的定義，其蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)的應(yīng)用是目前從藥效學(xué)角度來(lái)研究中藥歸經(jīng)問(wèn)題的最佳途徑和方法。在有條件的情況下，我們應(yīng)嘗試采用這一方法對(duì)歸經(jīng)理論進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。雖然我們不能肯定這種方法就能完全揭示歸經(jīng)理論的實(shí)質(zhì)，但無(wú)論其結(jié)果如何都會(huì)對(duì)歸經(jīng)理論的研究有所幫助和推進(jìn)，因?yàn)榭茖W(xué)上的任何成就都是在不斷總結(jié)前人成功和失敗的經(jīng)驗(yàn)基礎(chǔ)上取得的。

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篇8

蛋白質(zhì)組學(xué)簡(jiǎn)介

蛋白質(zhì)組（Proteome）一詞，源于蛋白質(zhì)（protein）與 基因組（genome）兩個(gè)詞的組合，意指“一種基因組所表達(dá)的全套蛋白質(zhì)”，即包括一種細(xì)胞乃至一種生物所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)組學(xué)本質(zhì)上指的是在大規(guī)模水平上研究蛋白質(zhì)的特征，包括蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，翻譯后的修飾，蛋白與蛋白相互作用等，由此獲得蛋白質(zhì)水平上的關(guān)于疾病發(fā)生，細(xì)胞代謝等過(guò)程的整體而全面的認(rèn)識(shí)，這個(gè)概念最早是由Marc Wilkins 在1994年提出的。

蛋白質(zhì)組（Proteome）的概念最先由Marc Wilkins提出，指由一個(gè)基因組（genome），或一個(gè)細(xì)胞、組織表達(dá)的所有蛋白質(zhì)（Protein）。蛋白質(zhì)組的概念與基因組的概念有許多差別，它隨著組織、甚至環(huán)境狀態(tài)的不同而改變. 在轉(zhuǎn)錄時(shí)，一個(gè)基因可以多種mRNA形式剪接，并且，同一蛋白可能以許多形式進(jìn)行翻譯后的修飾。故一個(gè)蛋白質(zhì)組不是一個(gè)基因組的直接產(chǎn)物，蛋白質(zhì)組中蛋白質(zhì)的數(shù)目有時(shí)可以超過(guò)基因組的數(shù)目。蛋白質(zhì)組學(xué)（Proteomics）處于早期“發(fā)育”狀態(tài)，這個(gè)領(lǐng)域的專家否認(rèn)它是單純的方法學(xué)，就像基因組學(xué)一樣，不是一個(gè)封閉的、概念化的穩(wěn)定的知識(shí)體系，而是一個(gè)領(lǐng)域。蛋白質(zhì)組學(xué)集中于動(dòng)態(tài)描述基因調(diào)節(jié)，對(duì)基因表達(dá)的蛋白質(zhì)水平進(jìn)行定量的測(cè)定，鑒定疾病、藥物對(duì)生命過(guò)程的影響，以及解釋基因表達(dá)調(diào)控的機(jī)制。作為一門科學(xué)，蛋白質(zhì)組研究并非從零開(kāi)始，它是已有20多年歷史的蛋白質(zhì)（多肽）譜和基因產(chǎn)物圖譜技術(shù)的一種延伸。多肽圖譜依靠雙向電泳（Two-dimensional gel electrophoresis， 2-DE）和進(jìn)一步的圖象分析；而基因產(chǎn)物圖譜依靠多種分離后的分析，如質(zhì)譜技術(shù)、氨基酸組分分析等。

蛋白質(zhì)組學(xué)在大豆與根瘤菌相互作用中的研究進(jìn)展

篇9

【摘要】 目的：研究梗阻性黃疸家兔血漿中蛋白質(zhì)電泳變化。方法：復(fù)制家兔梗阻性黃疸模型，用淀粉-瓊脂糖混合凝膠薄層電泳檢測(cè)血漿中蛋白質(zhì)電泳的變化。結(jié)果：血漿蛋白中α1球蛋白組分增多、纖維蛋白原增多;在血紅蛋白類物質(zhì)的三個(gè)區(qū)帶中，有一個(gè)區(qū)帶增多。結(jié)論：梗阻性黃疸家兔血漿中蛋白質(zhì)成分發(fā)生明顯變化，此變化是否與手術(shù)因素、黃疸因素或是機(jī)體對(duì)手術(shù)刺激的應(yīng)激反應(yīng)等有關(guān)，有待于深入研究。

【關(guān)鍵詞】 梗阻性黃疸;家兔;血漿蛋白;血紅蛋白

Abstract　Objective： To study the changes in plasma protein electrophoresis of rabbits with obstructive jaundice. Methods：Electrophoresis of agarose-starch mixed gel was used in these experiments. Results： There was an increases in α1 globulin and fibrinogen. Among the three electrophoresis zones of hemoglobin， there was an increase in one of them. Conclusions： There are some obvious changes in plasma protein elements of the rabbits with obstructive jaundice. It needs a further study to reveal if this is related to such factors as jaundice， operation or stress.

Key words　Obstructive jaundice; Rabbit ; Plasma protein; Hemoglobin

我們?cè)陉P(guān)于血漿中蛋白質(zhì)電泳變化與人類常見(jiàn)疾病關(guān)系的系列研究中發(fā)現(xiàn)，個(gè)別膽石癥等梗阻性黃疸患者血漿中蛋白質(zhì)電泳行為有變化，第一次電泳后原點(diǎn)殘留血紅蛋白量增多[1]，而目前國(guó)內(nèi)外有關(guān)梗阻性黃疸研究中，很少涉及血漿中蛋白質(zhì)的變化[2-5]。為了進(jìn)一步深入研究，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)復(fù)制家兔梗阻性黃疸動(dòng)物模型及蛋白質(zhì)電泳方法，探討梗阻性黃疸后血漿中蛋白質(zhì)的變化及其意義。

1　材料與方法

1.1　取材　采用膽總管結(jié)扎法復(fù)制家兔梗阻性黃疸模型，耳緣靜脈采血。

1.2　電泳及染色　采用淀粉-瓊脂糖混合凝膠薄層電泳。電泳完畢后將玻璃板置于麗春紅溶液染色過(guò)夜，次日取出晾干，再用聯(lián)苯胺溶液染色10 min，用漂洗液10 min，室溫晾干。

2　結(jié)果

2.1　家兔一般情況　家兔膽總管結(jié)扎術(shù)后12 h出現(xiàn)尿色加深，術(shù)后2 d出現(xiàn)皮膚及鞏膜黃染，糞便顏色變淺。隨梗阻時(shí)間延長(zhǎng)，家兔食欲減退，精神不振，反應(yīng)漸遲鈍，皮膚及鞏膜黃染加重。術(shù)后5 d時(shí)取血，血清總膽紅素、谷丙轉(zhuǎn)氨酶含量均明顯升高。

2.2　家兔梗阻性黃疸后血漿中蛋白質(zhì)的單向電泳　從圖1中泳道2可見(jiàn)，家兔梗阻性黃疸后α1球蛋白組分總體減少、其中慢泳成分增多，α2球蛋白組分增多，β球蛋白組分也增多;血紅蛋白類物質(zhì)區(qū)帶由三個(gè)變成兩個(gè)，其中快泳成分明顯多于慢泳者。從泳道4可見(jiàn)，家兔梗阻性黃疸后α1球蛋白組分減少不明顯、但其中慢泳成分明顯或增多，α2球蛋白組分減少，β球蛋白組分未增多，白蛋白減少;血紅蛋白類物質(zhì)三個(gè)區(qū)帶的中央成分明顯增多。

2.3　家兔梗阻性黃疸后血漿中蛋白質(zhì)的雙向電泳　家兔梗阻性黃疸后血漿中血漿蛋白的變化及血紅蛋白類物質(zhì)的變化，與單向電泳結(jié)果基本相同，見(jiàn)圖2。圖1　家兔梗阻性黃疸前、后血漿中蛋白質(zhì)的單向電泳

3　討論

梗阻性黃疸是由肝內(nèi)小膽管、肝總管或膽總管的機(jī)械性梗阻所致膽紅素沉著導(dǎo)致的皮膚與黏膜黃染，是臨床多發(fā)病之一，患者常出現(xiàn)肝、腎功能損害及消化道出血等一系列并發(fā)癥，嚴(yán)重危害機(jī)體健康甚至生命。目前，人們對(duì)梗阻性黃疸的研究多集中在分子生物學(xué)、血液流變學(xué)、影像學(xué)等幾方面，其中很少涉及有關(guān)血漿中蛋白質(zhì)的變化。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，家兔梗阻性黃疸后血漿中蛋白質(zhì)的電泳發(fā)生如下改變：(1)血漿蛋白中α1球蛋白組分增多，纖維蛋白原增多，白蛋白減少。(2)血紅蛋白類物質(zhì)含量增多。

人類α1球蛋白組分有α1抗胰蛋白酶、α1酸性糖蛋白等，在營(yíng)養(yǎng)不良、嚴(yán)重肝臟疾病、應(yīng)激等情況下均可增多。在肝臟疾病及應(yīng)激狀態(tài)下，白蛋白合成可減少。人類血漿中與血紅蛋白有關(guān)的成分有結(jié)合珠蛋白(haptoglobin，Hp)、血紅素結(jié)合蛋白(hemopexin，Hpx)。Hp位于α球蛋白區(qū)，Hpx位于β球蛋白區(qū)。Hp是一種α2糖蛋白，主要由肝臟合成，其功能是和血液中游離的血紅蛋白結(jié)合，防止體內(nèi)鐵的丟失，屬于一種急性反應(yīng)蛋白。一些人類Hp的研究表明，許多疾病可以引起體內(nèi)Hp含量的變化，而且某些疾病Hp含量的變化與疾病的嚴(yán)重程度相一致[7]。Hp廣泛存在與哺乳動(dòng)物體內(nèi)，但每種動(dòng)物Hp類型差異很大，且存在遺傳多態(tài)性[8]。Hpx和游離血紅素有特異結(jié)合能力，可配合結(jié)合珠蛋白對(duì)血紅蛋白進(jìn)行處理。Hpx可與血紅素可逆地結(jié)合，避免血紅蛋白和血紅素從腎排出體外，是機(jī)體有效地保存鐵的一種方式。已報(bào)道人類多種溶血性疾病、急慢性肝炎、肝癌、腎病綜合征病人Hpx含量降低，某些腫瘤、慢性神經(jīng)-肌肉病變病人Hpx含量升高[9]。有關(guān)家兔Hp或Hpx的含量及在梗阻性黃疸中發(fā)生變化的意義，尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究推測(cè)，梗阻性黃疸家兔血紅蛋白類物質(zhì)成分增多，可能與上述兩種蛋白有關(guān)。

家兔梗阻性黃疸前后血漿蛋白、血紅蛋白成分發(fā)生明顯變化。這些變化可能由黃疸因素、手術(shù)因素或是機(jī)體對(duì)手術(shù)刺激的應(yīng)激反應(yīng)等引起，有待進(jìn)一步研究確定。

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篇10

Expression of HSP in the mouse brain after shortterm learning and memory

【Abstract】 AIM: To investigate the association of heat shock proteins (HSP70 and HSP27) with shortterm learning and memory. METHODS: Thirty mice were randomly pided into 3 groups: Trained group（TG）， swimming control group （SC） and blank control group（BC）. After shortterm training， the mice were killed and the brains were prepared for tissue section. An immunohistochemical method was used in detecting HSP70 and HSP27 expression. RESULTS: A significant increase in HSP70 levels was observed in hippocampus， cerebral cortex and nucleus amygdala in shortterm trained group， a little expression in SC group and hardly no expression in BC group. But no HSP27 expression was found in all the 3 groups. CONCLUSION: HSP70 may be a critical molecule involved in shortterm learning and memory.

【Keywords】 learning; memory; Morris water maze; heatshock proteins 70; heatshock proteins 27; immunohistochemistry

【摘要】 目的： 建立小鼠短期學(xué)習(xí)記憶模型，研究熱休克蛋白70(HSP 70)、熱休克蛋白27(HSP 27)是否參與學(xué)習(xí)記憶過(guò)程. 方法： 采用Morris水迷宮建立學(xué)習(xí)記憶模型，同時(shí)設(shè)立游水對(duì)照組及空白對(duì)照組. 訓(xùn)練結(jié)束后處死小鼠，取腦，灌注固定腦組織，冰凍切片，免疫組化染色檢測(cè)腦組織中HSP70，HSP27的表達(dá)情況. 結(jié)果： 學(xué)習(xí)記憶模型組小鼠的海馬、杏仁核簇及大腦額葉皮質(zhì)高表達(dá)HSP70，游水對(duì)照組HSP70免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較少，空白對(duì)照組HSP70幾乎無(wú)表達(dá)；HSP27在各組均無(wú)表達(dá). 結(jié)論： HSP70可能是參與學(xué)習(xí)記憶的重要分子之一.

【關(guān)鍵詞】 學(xué)習(xí)；記憶；Morris水迷宮；熱休克蛋白質(zhì)70；熱休克蛋白質(zhì)27；免疫組織化學(xué)

0引言

學(xué)習(xí)和記憶的機(jī)制至今不明. 熱休克蛋白（heat shock protein， HSP）是一種在應(yīng)激狀態(tài)下產(chǎn)生的保護(hù)性蛋白質(zhì)，具有復(fù)雜的生物學(xué)功能. HSP與學(xué)習(xí)記憶的關(guān)系如何，目前此方面的報(bào)道并不多見(jiàn). 本文采用Morris水迷宮建立小鼠學(xué)習(xí)記憶模型，同時(shí)設(shè)立游水對(duì)照組和空白對(duì)照組，排除應(yīng)激因素所引起的HSP表達(dá)，觀察各組HSP表達(dá)的差異. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果可望為研究學(xué)習(xí)記憶的分子機(jī)制提供新的思路.

1材料和方法

1.1材料

雄性昆明種小鼠30只，6周齡，第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供. 利用隨機(jī)數(shù)字表將其均分為3組，即正常空白對(duì)照組（BC）、游水對(duì)照組(SC)和學(xué)習(xí)記憶模型組(TG). 飼養(yǎng)條件為（22±1）℃，相對(duì)濕度40%~50%，自然晝夜非直接光照，自由飲食. 實(shí)驗(yàn)前動(dòng)物適應(yīng)環(huán)境15 d，以避免環(huán)境應(yīng)激造成的HSP表達(dá)的變化.

1.2方法

1.2.1Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)程序及組織準(zhǔn)備Morris水迷宮（北京新天地科技公司）直徑為90 cm，高度50 cm. 水深27 cm，平臺(tái)置于水面下0.5～1 cm. 水溫（21±1）℃. 采用視頻圖象處理系統(tǒng)記錄小鼠尋找平臺(tái)的時(shí)間及軌跡圖. 參照Schimanski［1］的Morris水迷宮小鼠學(xué)習(xí)記憶模型建立方法，分為三個(gè)階段訓(xùn)練小鼠. 訓(xùn)練前期：將小鼠放置于平臺(tái)上，使其脫離平臺(tái)后，在水中自由游泳30 s，然后引導(dǎo)其到平臺(tái)上. 期間變換平臺(tái)位置，共進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)；訓(xùn)練期：將平臺(tái)固定在一個(gè)象限的中點(diǎn)，每只動(dòng)物從其它三個(gè)象限的任意位置頭面向池壁釋放入水. 記錄動(dòng)物游上平臺(tái)的時(shí)間及軌跡圖. 若60 s內(nèi)小鼠未找到平臺(tái)，人工將其引導(dǎo)至平臺(tái)，并使其停留30 s，將游泳時(shí)間記錄為60 s. 共進(jìn)行4 d實(shí)驗(yàn)，8次/d，前4次實(shí)驗(yàn)為一組，后4次實(shí)驗(yàn)為一組. 組與組之間間隔時(shí)間約1 h，組內(nèi)給予小鼠數(shù)分鐘休息時(shí)間；空間探索期： 在訓(xùn)練期最后一次實(shí)驗(yàn)結(jié)束之后，撤除平臺(tái)，讓小鼠在池中游泳60 s，用于測(cè)試小鼠學(xué)會(huì)尋找平臺(tái)后對(duì)站臺(tái)的記憶能力. 學(xué)習(xí)記憶組完全按照上述方法行水迷宮實(shí)驗(yàn)，游水對(duì)照組與學(xué)習(xí)記憶組配對(duì)，水中不放置平臺(tái)，使其游泳時(shí)間一致，也分4 d在同一時(shí)間進(jìn)行. 空白對(duì)照組在實(shí)驗(yàn)期間一直置于正常飼養(yǎng)環(huán)境中. 實(shí)驗(yàn)在10：00～16：00進(jìn)行，結(jié)束后將動(dòng)物送回飼養(yǎng)室. 空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)束后24 h用10 g/L戊巴比妥鈉麻醉小鼠，開(kāi)胸，暴露心臟，先用生理鹽水10 mL沖洗血液，然后用預(yù)冷的40 g/L的多聚甲醛(pH=7.4)固定液40 mL灌注固定完畢后取出全腦，后固定12 h，再將腦放入200 g/L的蔗糖溶液中，4℃過(guò)夜，組織塊完全沉底后，用冰凍切片機(jī)連續(xù)冠狀切片（冰凍切片機(jī)，Leica），厚度14 μm.

1.2.2免疫組織化學(xué)檢測(cè)采用生物素酶標(biāo)鏈霉親和素原理(即SP法)進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測(cè)（SP9003試劑盒，寶信公司）. 具體步驟如下，組織切片室溫滴加30 mL/L的H2O2，以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，加入試劑A(封閉用正常兔血清工作液)，孵育13 min，分別加山羊HSP70， HSP27多克隆抗體（1∶100， Santa Cruze 公司 ，李新民教授惠贈(zèng)）， 4℃過(guò)夜. 然后依次加入試劑B（生物素標(biāo)記兔抗山羊IgG二抗工作液）、試劑C（辣根酶標(biāo)記鏈酶素卵白素工作液），各置于室溫中15 min，以上各步驟間PBS充分沖洗. DAB棕色法顯色，脫水、透明、封片. 用無(wú)關(guān)抗體和PBS作替代或空白對(duì)照. 細(xì)胞質(zhì)棕黃色為陽(yáng)性信號(hào). 每組隨機(jī)取6張切片，每張切片取3個(gè)高倍視野（×40），進(jìn)行陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù).

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理： 學(xué)習(xí)記憶組 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用逐步回歸分析法，免疫陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果用x±s表示，用t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較，SPSS11.0軟件進(jìn)行處理.

2結(jié)果

2.1學(xué)習(xí)記憶模型的建立采用逐步回歸分析法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩個(gè)自變量(次數(shù)，天數(shù))進(jìn)入回歸方程，回歸方程為： Y=28.581-1.816X1-8.407X2，Y為時(shí)間（單位s），X1為次數(shù)，X2為天數(shù). 即說(shuō)明小鼠尋找平臺(tái)潛伏期與訓(xùn)練天數(shù)、次數(shù)有線性回歸關(guān)系. 隨著訓(xùn)練天數(shù)次數(shù)的增加，小鼠尋找水下隱藏平臺(tái)的能力得以提高. 空間探索實(shí)驗(yàn)階段根據(jù)小鼠在各個(gè)象限的時(shí)間分布，發(fā)現(xiàn)小鼠在平臺(tái)所處的象限游泳時(shí)間最長(zhǎng)，而且實(shí)驗(yàn)中可看到小鼠放入池中最先在目標(biāo)象限游泳. 對(duì)采集到的軌跡圖進(jìn)行分析，訓(xùn)練初期小鼠為邊緣式搜索，但在學(xué)習(xí)記憶模型建成后，大多都為直線趨向式(Fig 1).

2.2腦組織中HSP70，HSP27的表達(dá)學(xué)習(xí)記憶模型組腦組織細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有棕黃色沉淀物，在杏仁核簇、海馬和大腦額葉皮質(zhì)，陽(yáng)性反應(yīng)神經(jīng)元密集分布（Fig 2）. 而游水對(duì)照組陽(yáng)性細(xì)胞零星散布，空白對(duì)照組幾乎沒(méi)有陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)（Fig 3）. 學(xué)習(xí)記憶組HSP70陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(115.1±12.0)，明顯高于游水對(duì)照組(22.7±8.1， P＜0.05）. HSP27在各組間未有差異，均未達(dá)到免疫組化檢測(cè)水平.

3討論

Morris水迷宮是研究嚙齒類動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶的一種實(shí)驗(yàn)工具，簡(jiǎn)便易行. 強(qiáng)迫動(dòng)物游泳及迷宮環(huán)境對(duì)于動(dòng)物屬于一種應(yīng)激行為. 通過(guò)調(diào)節(jié)水溫可把這種應(yīng)激降低，但是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的神經(jīng)系統(tǒng)及內(nèi)分泌系統(tǒng)仍會(huì)發(fā)生一些改變，可能影響空間學(xué)習(xí)記憶形成過(guò)程中細(xì)胞分子的表達(dá). 神經(jīng)遞質(zhì)受體和生長(zhǎng)因子是參與學(xué)習(xí)記憶的主要細(xì)胞分子. 其中包括三種受體：親離子受體、促代謝受體和跨膜受體. 而生長(zhǎng)因子研究比較多的是腦源性生長(zhǎng)因子，Yamada等［2］發(fā)現(xiàn)其對(duì)學(xué)習(xí)記憶有重要作用. 突觸可塑性及神經(jīng)元所形成的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)是學(xué)習(xí)記憶的神經(jīng)生理基礎(chǔ). 對(duì)于長(zhǎng)期學(xué)習(xí)記憶，突觸結(jié)構(gòu)需要轉(zhuǎn)錄翻譯合成新的蛋白質(zhì). 而短期學(xué)習(xí)記憶，可以不需合成新的蛋白質(zhì)，它的形成與突觸局部變化有關(guān)，如酶的活化、蛋白質(zhì)的磷酸化及相應(yīng)的電生理的變化［3］. Lisman等［4］認(rèn)為鈣/鈣調(diào)節(jié)蛋白引起激酶Ⅱ（ CaMKⅡ）活性的改變是短期學(xué)習(xí)記憶的典型代表，通過(guò)此途徑使AMPM谷氨酸受體的活性增加，來(lái)調(diào)節(jié)突觸功能. 突觸蛋白Ⅰ，突觸結(jié)合蛋白Ⅰ，突觸融合蛋白等都是短期突觸可塑性的調(diào)節(jié)信號(hào). 本實(shí)驗(yàn)對(duì)小鼠短期學(xué)習(xí)記憶的分子機(jī)制進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)HSP70高表達(dá). 即Morris水迷宮短期學(xué)習(xí)記憶過(guò)程中有新的蛋白質(zhì)合成.

目前，各個(gè)領(lǐng)域都對(duì)HSP進(jìn)行了深入研究，分子伴侶是其最重要的生物學(xué)功能，此外還能裝配、折疊新合成的蛋白多肽，降解變性、錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)，調(diào)控調(diào)節(jié)蛋白的活性，參與細(xì)胞器、分泌蛋白膜轉(zhuǎn)位［5，6］. 研究［7］發(fā)現(xiàn)，預(yù)先給予熱休克處理，可對(duì)東莨菪堿誘發(fā)的記憶缺損起一種保護(hù)作用，即熱休克反應(yīng)產(chǎn)物HSP70可保護(hù)膽堿能受體不與東莨菪堿結(jié)合，從而維持學(xué)習(xí)記憶相關(guān)細(xì)胞分子的正常功能. 本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)HSP70可孤立于應(yīng)激因素，在短期學(xué)習(xí)記憶中表達(dá). Morris水迷宮環(huán)境（即游水對(duì)照組）可引起HSP70的表達(dá)，但是這種與迷宮相關(guān)的應(yīng)激并沒(méi)有引起HSP70表達(dá)的顯著變化，切片染色只有零星的免疫陽(yáng)性HSP70細(xì)胞. 而學(xué)習(xí)記憶組可看到密集的HSP70免疫陽(yáng)性細(xì)胞，這現(xiàn)象證明HSP70可能直接參與空間學(xué)習(xí)記憶的形成過(guò)程. 而HSP27在三個(gè)組均未有表達(dá)，說(shuō)明HSP27與學(xué)習(xí)記憶無(wú)關(guān). 新近研究［8］認(rèn)為，HSP27主要為一種抑制子，對(duì)于防止細(xì)胞凋亡起重要作用.

最新觀點(diǎn)［9］認(rèn)為特殊的學(xué)習(xí)記憶行為由特殊的腦區(qū)來(lái)完成，如暗示性學(xué)習(xí)記憶相關(guān)腦區(qū)為新皮質(zhì)、新紋狀體、小腦或杏仁體，外在性學(xué)習(xí)記憶主要依賴于海馬，工作性學(xué)習(xí)記憶建立在額前皮質(zhì)與其他腦區(qū)相互作用相互聯(lián)系的基礎(chǔ)之上. HSP在學(xué)習(xí)記憶信號(hào)通路中的詳細(xì)作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究. 我們可以從本實(shí)驗(yàn)中得到啟發(fā)，對(duì)于臨床上常見(jiàn)的輕度認(rèn)知功能障礙、癡呆性疾病，盡早對(duì)其進(jìn)行一些主動(dòng)功能訓(xùn)練，可能可以通過(guò)增加HSP的表達(dá)來(lái)提高其學(xué)習(xí)記憶能力.

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