血紅蛋白范文
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篇1
關(guān)鍵詞 血紅蛋白 生物學(xué)功能
中圖分類號(hào)：Q74文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A
動(dòng)物在呼吸時(shí)，氧氣和二氧化碳都要由血液內(nèi)的特殊運(yùn)載蛋白來運(yùn)輸。這類參與動(dòng)物呼吸作用的蛋白質(zhì)家族統(tǒng)稱為呼吸蛋白。Hb是呼吸蛋白家族的成員之一。Hb的主要功能是運(yùn)輸氧和二氧化碳,近年的研究表明，Hb還具有儲(chǔ)存能量、維持血液滲透壓和血壓、調(diào)節(jié)血漿酸堿平衡、抗菌、類氧化酶和過氧化酶活性的作用,屬于多功能蛋白。Hb已成為研究蛋白質(zhì)多重生物學(xué)功能的理想模式分子。
1 Hb的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)
血紅蛋白（hemoglobin，Hb）是生物體內(nèi)負(fù)責(zé)運(yùn)載氧的蛋白質(zhì)，也是紅細(xì)胞中唯一一種非膜蛋白。Hb由四個(gè)亞基構(gòu)成，每個(gè)亞基由一條肽鏈和一個(gè)血紅素分子構(gòu)成，肽鏈在生理?xiàng)l件下盤繞折疊成球形結(jié)構(gòu)稱之為珠蛋白，珠蛋白把血紅素分子抱在里面。血紅素是一個(gè)具有卟啉結(jié)構(gòu)的小分子，在卟啉分子中心，由卟啉中四個(gè)吡咯環(huán)上的氮原子與一個(gè)Fe2+ 配位結(jié)合，珠蛋白肽鏈中第8位的組氨酸殘基中的吲哚側(cè)鏈上的氮原子從卟啉分子平面的上方與Fe2+配位結(jié)合，F(xiàn)e2+居于環(huán)中，F(xiàn)e2+的6個(gè)配位鍵中有4個(gè)與吡咯環(huán)的N配位結(jié)合，1個(gè)與近端的HisF8結(jié)合，第6個(gè)用來結(jié)合O2等外源性配體，未結(jié)合配體時(shí)該配位鍵是空的，故生理狀態(tài)下Hb的血紅素-鐵是“五配位”形式。當(dāng)Hb不結(jié)合氧分子時(shí)，就有一個(gè)水分子從卟啉環(huán)下方與Fe2配位結(jié)合，4個(gè)珠蛋白亞基之間的相互作用力很強(qiáng),因此沒結(jié)合氧的血液呈淡藍(lán)色。當(dāng)Hb與氧結(jié)合時(shí)，則一個(gè)氧分子就頂替了水分子的位置形成氧合血紅蛋白(HbO2)，使血液呈鮮紅色。每個(gè)珠蛋白結(jié)合1個(gè)血紅素，其Fe2+可逆地結(jié)合1個(gè)氧分子。
因Hb所含亞基不同可將其分為不同的亞型，人體發(fā)育的不同階段，紅細(xì)胞內(nèi)所含的血紅蛋白亞型也不同。正常人出生后有血紅蛋白A（ 2 2）、血紅蛋白A2（ 2 2）、胎兒血紅蛋白（ 2 2）三種類型。
2 血紅蛋白基因的表達(dá)及進(jìn)化
血紅蛋白基因?qū)儆谏莩藁?，是指?dǎo)合成組織特異性蛋白的基因。Hb的不同肽鏈?zhǔn)怯刹煌倪z傳基因控制的。每個(gè)珠蛋白分子有二對(duì)肽鏈，一對(duì)是 鏈由141個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，含較多組氨酸，其中 87位（即F8）的組氨酸與血紅素鐵結(jié)合，另一對(duì)是非 鏈，有 、 、 、 及 5種。 鏈含146個(gè)氨基酸殘基、 93位的半胱氨酸易被氧化產(chǎn)生混合二硫化物及其它硫醚類質(zhì)，可降低Hb穩(wěn)定性。 鏈由146個(gè)氨基酸殘基組成，僅有10個(gè)氨基酸與 鏈不同。 鏈雖由146個(gè)氨基酸組成，但與 鏈有39個(gè)氨基酸不同，且含有4個(gè)異亮氨酸，為 、 與 鏈所缺。
人類編碼 珠蛋白的基因位于第16號(hào)染色體短臂(16p13.3)，每條染色體上有2個(gè) 基因 1和 2； 珠蛋白基因位于第11號(hào)染色體短臂1區(qū)2帶(11p1.2)。 和 珠蛋白基因位于第11染色體的11p13和11pter中間， 、 、 呈連鎖關(guān)系。
現(xiàn)在普遍認(rèn)為原始血紅蛋白基因與藻藍(lán)素基因共同起源于同一始祖血蛋白基因，通過內(nèi)含子的插入、滑鏈錯(cuò)配和缺失等不同機(jī)制逐漸演化出更多的血紅蛋白基因。植物、動(dòng)物共同的血紅蛋白基因繼續(xù)分別進(jìn)化為植物血紅蛋白基因和動(dòng)物血紅蛋白基因。動(dòng)物血紅蛋白基因有些丟失中心內(nèi)含子進(jìn)化為節(jié)肢動(dòng)物血紅蛋白基因，某些節(jié)肢動(dòng)物的血紅蛋白基因通過編碼區(qū)的改變和調(diào)控區(qū)的變化繼續(xù)進(jìn)化成脊椎動(dòng)物的、等球蛋白基因。①
3 血紅蛋白的生物學(xué)功能
Hb除具有運(yùn)輸O2和CO2的功能外,還具有運(yùn)輸硫化物、調(diào)節(jié)血漿酸堿平衡、維持血漿滲透壓和血壓、抗菌免疫等多種生物學(xué)功能，是目前研究最多的呼吸蛋白分子。
3.1 Hb的載氧功能
Hb 的載氧功能與其亞基結(jié)構(gòu)的2種狀態(tài)有關(guān)。在含氧豐富的肺中，亞基結(jié)構(gòu)呈松弛狀態(tài)（R 狀態(tài)），O2極易與血紅素結(jié)合成HbO2，HbO2將氧運(yùn)載至需氧組織；在缺氧組織中，亞基處于緊張狀態(tài)（T狀態(tài)），血紅素不能與氧結(jié)合，HbO2快速解離， 將O2釋放。②Hb與O2結(jié)合的過程是一個(gè)非常神奇的過程。首先一個(gè)O2與Hb的一個(gè)亞基結(jié)合，與O2結(jié)合之后的珠蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，引起整個(gè)Hb結(jié)構(gòu)的變化，這種變化使第二個(gè)O2更容易與Hb的另一個(gè)亞基結(jié)合，以此類推直到構(gòu)成Hb的四個(gè)亞基分別與四個(gè)O2結(jié)合。而在組織內(nèi)釋放氧的過程也是這樣，一個(gè)O2的離去會(huì)刺激另一個(gè)O2的離去，直到完全釋放所有的O2，這種現(xiàn)象稱為協(xié)同效應(yīng)。血紅素分子結(jié)構(gòu)由于協(xié)同效應(yīng)，Hb與O2的結(jié)合曲線呈S形，在特定范圍內(nèi)隨著環(huán)境中氧含量的變化，其結(jié)合率有一個(gè)劇烈變化的過程，生物體內(nèi)組織中的氧濃度和肺組織中的氧濃度恰好位于這一突變的兩側(cè)，因而在肺組織，Hb可以充分地與O2結(jié)合，在體內(nèi)其它組織處則可以充分地釋放所攜帶的O2。當(dāng)環(huán)境中的氧含量過高或過低的時(shí)，氧結(jié)合曲線卻非常平緩，Hb與O2的結(jié)合率沒有顯著變化，因此健康人即使呼吸純氧，血液運(yùn)載氧的能力也不會(huì)有顯著的提高，從這個(gè)角度講，對(duì)健康人而言吸氧所產(chǎn)生心理暗示要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其生理作用。
3.2 Hb的維持血壓功能
研究發(fā)現(xiàn)，Hb在通過血液運(yùn)輸氧的同時(shí)，可以釋放自身產(chǎn)生的NO來補(bǔ)充因代謝而失去的NO。NO 能擴(kuò)張毛細(xì)血管，控制毛細(xì)血管內(nèi)的血流量，起到穩(wěn)定血壓的作用。Hb所釋放的NO具有一股“沖刺力”的作用，能夠幫助O2到達(dá)人體的各種組織，并且這種NO又能幫助Hb清除CO2等廢物。
3.3 Hb的抗菌免疫功能
法國(guó)學(xué)者Nedjar-Arroume等利用純化的Hb片段研究發(fā)現(xiàn)，Hb片段對(duì)大腸桿菌、腸炎沙門氏菌、藤黃微球菌A270和無毒李斯特菌具有明顯的抑菌活性 。新加坡學(xué)者Jiang 等 研究發(fā)現(xiàn)Hb能有效抗金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌等細(xì)菌，具有殺滅致病細(xì)菌的作用。周新娥③等在大鼠體內(nèi)的試驗(yàn)證明，人Hb及其片段具有體外抑制細(xì)菌的作用, 而且Hb在大鼠體內(nèi)能減輕大腸桿菌感染炎癥的程度。免疫學(xué)認(rèn)為,當(dāng)人體受到細(xì)菌入侵時(shí),首先啟動(dòng)細(xì)胞免疫，即在識(shí)別異己的基礎(chǔ)上，調(diào)動(dòng)免疫細(xì)胞殺死入侵細(xì)菌。細(xì)胞免疫反應(yīng)涉及多個(gè)步驟,需要很長(zhǎng)時(shí)間才能完成。近年研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)人體與入侵微生物作戰(zhàn)時(shí),紅細(xì)胞內(nèi)的Hb會(huì)釋放出活性氧,活性氧能迅速殺死入侵的致病微生物。并且,病原體越厲害, Hb產(chǎn)生的活性氧就越多。雖然Hb自動(dòng)氧化率很低, 但是產(chǎn)生活性氧的能力很強(qiáng)，這可能與超氧化物岐化酶的活性有關(guān)。Kawano 等研究發(fā)現(xiàn)當(dāng) Hb 自動(dòng)氧化成高鐵血紅蛋白時(shí),具有一種類過氧化物酶的活性,能催化產(chǎn)生超氧陰離子,進(jìn)而產(chǎn)生有毒的衍生物,如羥基自由基等起到滅菌的作用。Decker 等認(rèn)為，動(dòng)物機(jī)體可任意利用入侵微生物的毒力因子，使自身的Hb自動(dòng)氧化而獲得強(qiáng)力的制造活性氧的能力, 產(chǎn)生大量的活性氧介導(dǎo)抗菌功能, 有效地殺滅入侵微生物。并認(rèn)為這一直接抗菌機(jī)制的存在可能已超過了50億年并不斷地被強(qiáng)化?；钚匝鯇?duì)抑制能產(chǎn)生胞外蛋白酶等毒力因子的有毒細(xì)菌十分有效，即便某些病原菌對(duì)抗生素產(chǎn)生了抗藥性,但仍有可能被Hb產(chǎn)生的活性氧所殺死。Hb抑菌功能的發(fā)現(xiàn)對(duì)臨床治療已產(chǎn)生抗生素抗藥性的病原菌尤為重要。Hb已被學(xué)術(shù)界認(rèn)為是動(dòng)物體內(nèi)的一種重要的免疫分子。④
3.4 Hb能維持血漿滲透壓穩(wěn)定
Hb能維持血漿酸堿平衡和滲透壓穩(wěn)定，具有波爾效應(yīng)。Hb分布于血漿和血細(xì)胞內(nèi)，在血細(xì)胞內(nèi)的Hb分子量較小，一般在2萬至12萬，而血漿中的Hb分子量較大，從40萬至幾百萬。溶解血漿中的Hb大分子實(shí)際上是由Hb分子聚集而成的，血漿中溶解的大分子數(shù)目增加使血漿膠體滲透壓增加，而膠體滲透壓增加會(huì)影響組織液的生成及腎臟的濾過作用等，起調(diào)節(jié)血漿滲透壓的作用。⑤
4 結(jié)語和展望
Hb等呼吸蛋白的主要功能是運(yùn)載O2，但基因結(jié)構(gòu)的變異導(dǎo)致Hb等呼吸蛋白的結(jié)構(gòu)多變并衍生出更多的功能，成為多功能蛋白。隨著Hb等呼吸蛋白的抗菌免疫能力以及類氧化酶、過氧化酶活性等多種功能的不斷發(fā)現(xiàn)，越來越引起研究者的興趣。今后，對(duì)Hb的研究將著重探索其新功能及作用機(jī)理,尤其是在非特異性免疫反應(yīng)中所發(fā)揮的作用。對(duì)Hb 的深入研究，將有助于拓展人們對(duì)Hb所肩負(fù)的多重生物學(xué)功能的認(rèn)知，也可為人們開發(fā)抗菌、抗病毒藥物提供新的思路。
注釋
① 汪青,項(xiàng)榮花,包永波,林志華.動(dòng)物血紅蛋白研究進(jìn)展[J].寧波大學(xué)學(xué)報(bào)(理工版),2011.24(2):20-24.
② 王鏡巖,朱勝庚,徐長(zhǎng)法.生物化學(xué)(上冊(cè))[M].北京:高等教育出版社,2002:257-270.
③ 周新娥,歐陽運(yùn)薇,潘小玲,等.人血紅蛋白及其片段體內(nèi)外抗菌活性研究[J].四川大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版,2008.39(3):355-359.
篇2
[關(guān)鍵詞] 血紅蛋白濃度；三酰甘油測(cè)定；監(jiān)測(cè)變化
[中圖分類號(hào)] R446.11 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] C[文章編號(hào)] 1674-4721（2011）02（c）-069-02
血脂代謝異常與動(dòng)脈粥樣硬化，心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展有密切關(guān)系。由于人們生活水平的提高和飲食結(jié)構(gòu)的不均衡，健康人群的體檢工作越來越受到重視。本文通過對(duì)健康人群的血紅蛋白與血脂檢測(cè)分析，初步探討了兩者在臨床患者中的應(yīng)用價(jià)值和相關(guān)性。
1資料與方法
1.1一般資料
隨機(jī)抽取2009年來本院做健康體檢的企事業(yè)單位職工582例，其中，男性366例，女性216例。成年男性血紅蛋白濃度在120~173 g/L，成年女性血紅蛋白濃度在110~151 g/L，血糖尿糖測(cè)定結(jié)果均在正常范圍內(nèi)的人群作為研究對(duì)象。
1.2方法
健康體檢者禁食至少12 h以上，于次日清晨空腹抽取靜脈血。采用奧林巴斯AU640全自動(dòng)生化分析儀測(cè)血脂濃度，試劑使用原裝配套試劑。使用東亞K-21血球分析儀測(cè)定血紅蛋白含量。
2 結(jié)果
男性血紅蛋白不同濃度正常范圍的兩組人群相比較：所對(duì)應(yīng)的三酰甘油水平有極其顯著性差異，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，χ2＝21.28，查χ2界值表得P＜0.01，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。女性血紅蛋白不同濃度正常范圍的兩組人群相比較，結(jié)果無顯著性差異，χ2=0.88，P＞0.05。見表1、2。
3討論
血紅蛋白是人體紅細(xì)胞內(nèi)的主要蛋白質(zhì)，它是一種呼吸載體，能把氧從肺運(yùn)到身體組織，擔(dān)負(fù)重要的生理功能。成年男性參考值：131~172 g/L，成年女性參考值：110~151 g/L。病理性增加見于真性紅細(xì)胞增多癥，代償性紅細(xì)胞增多癥等[1]。而脂類代謝紊亂是心腦血管疾病的重要危險(xiǎn)因素?？茖W(xué)研究顯示，三酰甘油高已成為動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病及其他心血管疾病的重要危險(xiǎn)因素之一[2-3]。高脂血癥在動(dòng)脈粥樣硬化，冠心病和腦血栓形成等心腦血管疾病的諸多因素中占了重要地位，三酰甘油水平升高在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展過程中起著重要作用，與人群中冠心病的患病率與死亡率呈顯著正相關(guān)。這些變化均是引起心腦血管疾病的重要因素[4-5]。越來越多的研究顯示血清高三酰甘油癥也是心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，是衡量健康的一個(gè)重要指標(biāo)。我國(guó)1997年提出血脂異常防治建議[6]。此外，三酰甘油高的危害還包括引發(fā)高血壓、膽結(jié)石、胰腺炎；還能夠加重肝炎、致使男性障礙、導(dǎo)致老年癡呆等。研究表明，三酰甘油高的后果還可能導(dǎo)致癌癥的發(fā)生。正常人三酰甘油水平高低受生活條件影響，包括吸煙，膳食高膽固醇和脂肪，高鹽攝入，飲酒，不運(yùn)動(dòng)，飲食結(jié)構(gòu)的不合理，不科學(xué)等。
通過本文對(duì)582例健康成年男女的血紅蛋白與三酰甘油檢測(cè)分析，可見男女兩組血紅蛋白濃度雖然都是在正常范圍內(nèi)，但是，男性三酰甘油檢測(cè)結(jié)果兩組卻有著極顯著性差異。女性兩組測(cè)定結(jié)果差異無著性。由于延邊地區(qū)男性喜歡飲酒，吸煙等不良生活習(xí)慣所致，對(duì)于血紅蛋白濃度在140~173 g/L范圍內(nèi)的男性人群需引起臨床的高度重視，應(yīng)該做好疾病的健康教育，使血脂保持一定正常水平之內(nèi)， 減少或降低心腦血管病的發(fā)病率。三酰甘油高的危害是非常多的，不要因?yàn)檩p度三酰甘油高沒有明顯癥狀就忽視了它的存在。男性在檢測(cè)血常規(guī)的過程中，如發(fā)現(xiàn)血紅蛋白濃度在140~173 g/L范圍內(nèi)，有必要做一下血脂檢查。三酰甘油高的后果嚴(yán)重，要想遠(yuǎn)離，早防早治是根本。血紅蛋白在高脂血癥發(fā)病機(jī)制中的作用值得進(jìn)一步研究探討。
[參考文獻(xiàn)]
[1]叢玉隆,金大鳴,王鴻利,等.中國(guó)人群成人靜脈血血細(xì)胞分析參考范圍調(diào)查[J].中華醫(yī)學(xué)雜志,2003,83(14):1201-1205.
[2]陳太照.我院812 例血脂檢測(cè)結(jié)果分析報(bào)道[J].檢驗(yàn)與臨床,2010,48(22):77.
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[4]劉軍.北京地區(qū)自然人群血脂水平分布[J].心腦血管病雜志,2001,21(3):137.
[5]房利民.血脂檢測(cè)對(duì)冠心病患者的臨床應(yīng)用價(jià)值[J].臨床實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2008,7(2):81.
篇3
血紅蛋白的提取和分離一般步驟為樣品處理、粗分離、純化和純度鑒定。
1 樣品處理
1.1 紅細(xì)胞的洗滌
洗滌紅細(xì)胞的目的是去除雜蛋白，采集的血樣要及時(shí)采用低速短時(shí)間離心分離紅細(xì)胞，然后用膠頭吸管吸出上層透明的黃色血漿，將下層暗紅色的紅細(xì)胞液體倒入燒杯，再加入五倍體積的生理鹽水，緩慢攪拌10min，低速短時(shí)間離心，如此重復(fù)洗滌3次，直至上清液中沒有黃色，表明紅細(xì)胞已洗滌干凈。
1.2 血紅蛋白的釋放
在蒸餾水和甲苯作用下，紅細(xì)胞破裂釋放出血紅蛋白，加入蒸餾水后紅細(xì)胞液體積與原血液體積要相同。加入甲苯的目的是溶解細(xì)胞膜，有利于血紅蛋白的釋放和分離。
2 粗分離
2.1 分離血紅蛋白溶液
將攪拌好的混合溶液離心后，試管中的溶液分為4層。第1層為無色透明的甲苯層，第2層為白色薄層固體，是脂溶性物質(zhì)的沉淀層，第3層是紅色透明液體，這是血紅蛋白的水溶液，第4層是其他雜質(zhì)的暗紅色沉淀物。將試管中的液體用濾紙過濾，除去脂溶性沉淀層，于分液漏斗中靜置片刻后，分出下層的紅色透明液體。
2.2 透析
取1mL的血紅蛋白溶液裝入透析袋中，將透析袋放入盛有300mL的物質(zhì)的量濃度為20mmol／L的磷酸緩沖液中，透析12h。透析可以去除樣品中分子量較小的雜質(zhì)。
3 純化
利用凝膠色譜柱可對(duì)血紅蛋白進(jìn)行純化(圖1)。
4 純度鑒定
使用最多的是SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。
5 血紅蛋白的提取和分離操作問題分析
5.1 血紅蛋白的提取
紅細(xì)胞分層不明顯，可能是洗滌次數(shù)少，未能除去血漿蛋白的原因。此外，離心速度過高和時(shí)間過長(zhǎng)，會(huì)使白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞一同沉淀，也得不到純凈的紅細(xì)胞，影響后續(xù)血紅蛋白的提取純度。
5.2 檢測(cè)凝膠色譜柱的裝填是否成功的方法
由于凝膠是一種半透明的介質(zhì)，因此可以在凝膠柱旁放一支與凝膠柱垂直的日光燈，檢查凝膠是否裝填得均勻。此外，還可以加入大分子的有色物質(zhì)，觀察色帶移動(dòng)的情況。如果色帶均勻、狹窄、平整，說明凝膠色譜柱的性能良好。如果色譜柱出現(xiàn)紋路或是氣泡，輕輕敲打柱體以消除氣泡，消除不了時(shí)要重新裝柱。
5.3 凝膠的裝填標(biāo)準(zhǔn)：緊密、均勻
如果凝膠裝填得不夠緊密、均勻，就會(huì)在色譜柱內(nèi)形成無數(shù)的空隙，使本該進(jìn)入凝膠內(nèi)部的樣品分子從這些空隙中通過，擾亂洗脫液的流動(dòng)次序，影響分離的效果。
5.4 沸水浴處理加入洗脫液的濕凝膠的目的
這樣操作不但節(jié)約時(shí)間，還能除去凝膠中可能帶有的微生物，排除凝膠內(nèi)的空氣。
5.5 G--75
“G”代表凝膠的交聯(lián)程度、膨脹程度及分離范圍，75表示凝膠得水值，即每克凝膠膨脹時(shí)吸水7.5g。
5.6 裝填完后，立即用洗脫液洗脫的目的
此操作的目的是使凝膠裝填緊密。
5.7 實(shí)驗(yàn)過程加入檸檬酸鈉
加入檸檬酸鈉的目的是防止血液凝固；低速、短時(shí)離心防止白細(xì)胞沉淀；緩慢攪拌防止紅細(xì)胞破裂釋放出血紅蛋白。
5.8 檢測(cè)血紅蛋白的分離是否成功的方法
如果凝膠色譜柱裝填得很成功、分離操作也正確的話，能清楚地看到血紅蛋白的紅色區(qū)帶均勻、狹窄、平整，隨著洗脫液緩慢流出；如果紅色區(qū)帶歪曲、散亂、變寬，說明分離的效果不好，這與凝膠色譜柱的裝填有關(guān)。
6 典型例題
【例1】在血紅蛋白的提取和分離實(shí)驗(yàn)中，下列操作正確的是( )
A 分離紅細(xì)胞時(shí)需去除上層透明的黃色血漿
B 紅細(xì)胞釋放出血紅蛋白時(shí)只需加入蒸餾水
C 分離血紅蛋白溶液是低速短時(shí)間離心
D 洗脫時(shí)，待紅色蛋白質(zhì)下移即開始收集流出液
思維啟導(dǎo)：紅細(xì)胞釋放出血紅蛋白除需加入蒸餾水，還需加入40％體積的甲苯；分離血紅蛋白溶液是高速長(zhǎng)時(shí)間離心；洗脫時(shí)，待紅色蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時(shí)，用試管收集流出液，每5 mL收集一管，連續(xù)收集。
參考答案：A。
【例2】下列有關(guān)提取和分離血紅蛋白的程序，敘述錯(cuò)誤的是( )
A 樣品的處理就是通過一系列操作收集到血紅蛋白溶液
B 通過透析可能去除樣品中相對(duì)分子質(zhì)量較大的雜質(zhì)，此為樣品的粗提取
C 可通過凝膠色譜法將相對(duì)分子質(zhì)量大的雜質(zhì)蛋白除去，即樣品的純化
D 可通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定血紅蛋白的純度
思維啟導(dǎo)：首先通過洗滌紅細(xì)胞、血紅蛋白的釋放、離心等操作收集到血紅蛋白溶液，即樣品的處理；再經(jīng)過透析去除相對(duì)分子質(zhì)量較小的雜質(zhì)，即樣品的粗分離；然后通過凝膠色譜法將相對(duì)分子質(zhì)量大的雜質(zhì)蛋白除去，即樣品的純化；最后經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行純度鑒定，由此可知B的敘述錯(cuò)誤。由玻璃紙制成的透析袋能使小分子自由進(jìn)出，而將大分子保留在袋內(nèi)，透析可以去除樣品中相對(duì)分子質(zhì)量較小的雜質(zhì)。
參考答案：B。
【例3】紅細(xì)胞含有大量的血紅蛋白，紅細(xì)胞的機(jī)能主要是由血紅蛋白完成，血紅蛋白的主要功能是攜帶氧氣或二氧化碳，我們可以選用豬、牛、羊或其他脊椎動(dòng)物的血液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，來提取和分離血紅蛋白，請(qǐng)回答下列有關(guān)問題：
(1)實(shí)驗(yàn)前取新鮮的血液，要切記在采血容器中預(yù)先加入檸檬酸鈉，取血回來，馬上進(jìn)行離心，收集血紅蛋白溶液。
①加入檸檬酸鈉的目的是___________。
②以上所述的過程即是樣品處理，它包括__________、_________、收集血紅蛋白溶液。
(2)收集的血紅蛋白溶液在透析袋中可以經(jīng)過透析，這就是樣品的粗分離。
①透析的目的是
②透析的原理是
(3)然后通過凝膠色譜法將樣品進(jìn)一步純化，最后經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行純度鑒定。
①樣品純化的目的是__________。
②血紅蛋白有什么特點(diǎn)?
這一特點(diǎn)對(duì)進(jìn)行蛋白質(zhì)的分離有什么意義?
思維啟導(dǎo)：檸檬酸鈉是一種抗凝劑，能夠防止血液凝固。凝膠色譜柱中如果產(chǎn)生了氣泡，氣泡就會(huì)攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果。
參考答案：
(1)①防止血液凝固
②紅細(xì)胞的洗滌血紅蛋白的釋放
(2)①去除分子質(zhì)量較小的雜質(zhì)
②透析袋能使小分子自由進(jìn)出，而大分子則保留在袋內(nèi)
(3)①通過凝膠色譜法將相對(duì)分子質(zhì)量大的雜質(zhì)蛋白除去
篇4
關(guān)鍵詞 血紅蛋白 生物學(xué)功能
中圖分類號(hào):Q74文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A
動(dòng)物在呼吸時(shí),氧氣和二氧化碳都要由血液內(nèi)的特殊運(yùn)載蛋白來運(yùn)輸。這類參與動(dòng)物呼吸作用的蛋白質(zhì)家族統(tǒng)稱為呼吸蛋白。Hb是呼吸蛋白家族的成員之一。Hb的主要功能是運(yùn)輸氧和二氧化碳,近年的研究表明,Hb還具有儲(chǔ)存能量、維持血液滲透壓和血壓、調(diào)節(jié)血漿酸堿平衡、抗菌、類氧化酶和過氧化酶活性的作用,屬于多功能蛋白。Hb已成為研究蛋白質(zhì)多重生物學(xué)功能的理想模式分子。
1 Hb的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)
血紅蛋白(hemoglobin,Hb)是生物體內(nèi)負(fù)責(zé)運(yùn)載氧的蛋白質(zhì),也是紅細(xì)胞中唯一一種非膜蛋白。Hb由四個(gè)亞基構(gòu)成,每個(gè)亞基由一條肽鏈和一個(gè)血紅素分子構(gòu)成,肽鏈在生理?xiàng)l件下盤繞折疊成球形結(jié)構(gòu)稱之為珠蛋白,珠蛋白把血紅素分子抱在里面。血紅素是一個(gè)具有卟啉結(jié)構(gòu)的小分子,在卟啉分子中心,由卟啉中四個(gè)吡咯環(huán)上的氮原子與一個(gè)Fe2 配位結(jié)合,珠蛋白肽鏈中第8位的組氨酸殘基中的吲哚側(cè)鏈上的氮原子從卟啉分子平面的上方與Fe2 配位結(jié)合,Fe2 居于環(huán)中,Fe2 的6個(gè)配位鍵中有4個(gè)與吡咯環(huán)的N配位結(jié)合,1個(gè)與近端的HisF8結(jié)合,第6個(gè)用來結(jié)合O2等外源性配體,未結(jié)合配體時(shí)該配位鍵是空的,故生理狀態(tài)下Hb的血紅素-鐵是“五配位”形式。當(dāng)Hb不結(jié)合氧分子時(shí),就有一個(gè)水分子從卟啉環(huán)下方與Fe2配位結(jié)合,4個(gè)珠蛋白亞基之間的相互作用力很強(qiáng),因此沒結(jié)合氧的血液呈淡藍(lán)色。當(dāng)Hb與氧結(jié)合時(shí),則一個(gè)氧分子就頂替了水分子的位置形成氧合血紅蛋白(HbO2),使血液呈鮮紅色。每個(gè)珠蛋白結(jié)合1個(gè)血紅素,其Fe2 可逆地結(jié)合1個(gè)氧分子。
因Hb所含亞基不同可將其分為不同的亞型,人體發(fā)育的不同階段,紅細(xì)胞內(nèi)所含的血紅蛋白亞型也不同。正常人出生后有血紅蛋白A( 2 2)、血紅蛋白A2( 2 2)、胎兒血紅蛋白( 2 2)三種類型。
2 血紅蛋白基因的表達(dá)及進(jìn)化
血紅蛋白基因?qū)儆谏莩藁?是指導(dǎo)合成組織特異性蛋白的基因。Hb的不同肽鏈?zhǔn)怯刹煌倪z傳基因控制的。每個(gè)珠蛋白分子有二對(duì)肽鏈,一對(duì)是 鏈由141個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成,含較多組氨酸,其中 87位(即F8)的組氨酸與血紅素鐵結(jié)合,另一對(duì)是非 鏈,有 、 、 、 及 5種。 鏈含146個(gè)氨基酸殘基、 93位的半胱氨酸易被氧化產(chǎn)生混合二硫化物及其它硫醚類質(zhì),可降低Hb穩(wěn)定性。 鏈由146個(gè)氨基酸殘基組成,僅有10個(gè)氨基酸與 鏈不同。 鏈雖由146個(gè)氨基酸組成,但與 鏈有39個(gè)氨基酸不同,且含有4個(gè)異亮氨酸,為 、 與 鏈所缺。
人類編碼 珠蛋白的基因位于第16號(hào)染色體短臂(16p13.3),每條染色體上有2個(gè) 基因 1和 2; 珠蛋白基因位于第11號(hào)染色體短臂1區(qū)2帶(11p1.2)。 和 珠蛋白基因位于第11染色體的11p13和11pter中間, 、 、 呈連鎖關(guān)系。
現(xiàn)在普遍認(rèn)為原始血紅蛋白基因與藻藍(lán)素基因共同起源于同一始祖血蛋白基因,通過內(nèi)含子的插入、滑鏈錯(cuò)配和缺失等不同機(jī)制逐漸演化出更多的血紅蛋白基因。植物、動(dòng)物共同的血紅蛋白基因繼續(xù)分別進(jìn)化為植物血紅蛋白基因和動(dòng)物血紅蛋白基因。動(dòng)物血紅蛋白基因有些丟失中心內(nèi)含子進(jìn)化為節(jié)肢動(dòng)物血紅蛋白基因,某些節(jié)肢動(dòng)物的血紅蛋白基因通過編碼區(qū)的改變和調(diào)控區(qū)的變化繼續(xù)進(jìn)化成脊椎動(dòng)物的、等球蛋白基因。①
3 血紅蛋白的生物學(xué)功能
Hb除具有運(yùn)輸O2和CO2的功能外,還具有運(yùn)輸硫化物、調(diào)節(jié)血漿酸堿平衡、維持血漿滲透壓和血壓、抗菌免疫等多種生物學(xué)功能,是目前研究最多的呼吸蛋白分子。
3.1 Hb的載氧功能
Hb 的載氧功能與其亞基結(jié)構(gòu)的2種狀態(tài)有關(guān)。在含氧豐富的肺中,亞基結(jié)構(gòu)呈松弛狀態(tài)(R 狀態(tài)),O2極易與血紅素結(jié)合成HbO2,HbO2將氧運(yùn)載至需氧組織;在缺氧組織中,亞基處于緊張狀態(tài)(T狀態(tài)),血紅素不能與氧結(jié)合,HbO2快速解離, 將O2釋放。②Hb與O2結(jié)合的過程是一個(gè)非常神奇的過程。首先一個(gè)O2與Hb的一個(gè)亞基結(jié)合,與O2結(jié)合之后的珠蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,引起整個(gè)Hb結(jié)構(gòu)的變化,這種變化使第二個(gè)O2更容易與Hb的另一個(gè)亞基結(jié)合,以此類推直到構(gòu)成Hb的四個(gè)亞基分別與四個(gè)O2結(jié)合。而在組織內(nèi)釋放氧的過程也是這樣,一個(gè)O2的離去會(huì)刺激另一個(gè)O2的離去,直到完全釋放所有的O2,這種現(xiàn)象稱為協(xié)同效應(yīng)。血紅素分子結(jié)構(gòu)由于協(xié)同效應(yīng),Hb與O2的結(jié)合曲線呈S形,在特定范圍內(nèi)隨著環(huán)境中氧含量的變化,其結(jié)合率有一個(gè)劇烈變化的過程,生物體內(nèi)組織中的氧濃度和肺組織中的氧濃度恰好位于這一突變的兩側(cè),因而在肺組織,Hb可以充分地與O2結(jié)合,在體內(nèi)其它組織處則可以充分地釋放所攜帶的O2。當(dāng)環(huán)境中的氧含量過高或過低的時(shí),氧結(jié)合曲線卻非常平緩,Hb與O2的結(jié)合率沒有顯著變化,因此健康人即使呼吸純氧,血液運(yùn)載氧的能力也不會(huì)有顯著的提高,從這個(gè)角度講,對(duì)健康人而言吸氧所產(chǎn)生心理暗示要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其生理作用。
3.2 Hb的維持血壓功能
研究發(fā)現(xiàn),Hb在通過血液運(yùn)輸氧的同時(shí),可以釋放自身產(chǎn)生的NO來補(bǔ)充因代謝而失去的NO。NO 能擴(kuò)張毛細(xì)血管,控制毛細(xì)血管內(nèi)的血流量,起到穩(wěn)定血壓的作用。Hb所釋放的NO具有一股“沖刺力”的作用,能夠幫助O2到達(dá)人體的各種組織,并且這種NO又能幫助Hb清除CO2等廢物。
3.3 Hb的抗菌免疫功能
法國(guó)學(xué)者Nedjar-Arroume等利用純化的Hb片段研究發(fā)現(xiàn),Hb片段對(duì)大腸桿菌、腸炎沙門氏菌、藤黃微球菌A270和無毒李斯特菌具有明顯的抑菌活性 。新加坡學(xué)者Jiang 等 研究發(fā)現(xiàn)Hb能有效抗金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌等細(xì)菌,具有殺滅致病細(xì)菌的作用。周新娥③等在大鼠體內(nèi)的試驗(yàn)證明,人Hb及其片段具有體外抑制細(xì)菌的作用, 而且Hb在大鼠體內(nèi)能減輕大腸桿菌感染炎癥的程度。免疫學(xué)認(rèn)為,當(dāng)人體受到細(xì)菌入侵時(shí),首先啟動(dòng)細(xì)胞免疫,即在識(shí)別異己的基礎(chǔ)上,調(diào)動(dòng)免疫細(xì)胞殺死入侵細(xì)菌。細(xì)胞免疫反應(yīng)涉及多個(gè)步驟,需要很長(zhǎng)時(shí)間才能完成。近年研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)人體與入侵微生物作戰(zhàn)時(shí),紅細(xì)胞內(nèi)的Hb會(huì)釋放出活性氧,活性氧能迅速殺死入侵的致病微生物。并且,病原體越厲害, Hb產(chǎn)生的活性氧就越多。雖然Hb自動(dòng)氧化率很低, 但是產(chǎn)生活性氧的能力很強(qiáng),這可能與超氧化物岐化酶的活性有關(guān)。Kawano 等研究發(fā)現(xiàn)當(dāng) Hb 自動(dòng)氧化成高鐵血紅蛋白時(shí),具有一種類過氧化物酶的活性,能催化產(chǎn)生超氧陰離子,進(jìn)而產(chǎn)生有毒的衍生物,如羥基自由基等起到滅菌的作用。Decker 等認(rèn)為,動(dòng)物機(jī)體可任意利用入侵微生物的毒力因子,使自身的Hb自動(dòng)氧化而獲得強(qiáng)力的制造活性氧的能力, 產(chǎn)生大量的活性氧介導(dǎo)抗菌功能, 有效地殺滅入侵微生物。并認(rèn)為這一直接抗菌機(jī)制的存在可能已超過了50億年并不斷地被強(qiáng)化?；钚匝鯇?duì)抑制能產(chǎn)生胞外蛋白酶等毒力因子的有毒細(xì)菌十分有效,即便某些病原菌對(duì)抗生素產(chǎn)生了抗藥性,但仍有可能被Hb產(chǎn)生的活性氧所殺死。Hb抑菌功能的發(fā)現(xiàn)對(duì)臨床治療已產(chǎn)生抗生素抗藥性的病原菌尤為重要。Hb已被學(xué)術(shù)界認(rèn)為是動(dòng)物體內(nèi)的一種重要的免疫分子。④
3.4 Hb能維持血漿滲透壓穩(wěn)定
Hb能維持血漿酸堿平衡和滲透壓穩(wěn)定,具有波爾效應(yīng)。Hb分布于血漿和血細(xì)胞內(nèi),在血細(xì)胞內(nèi)的Hb分子量較小,一般在2萬至12萬,而血漿中的Hb分子量較大,從40萬至幾百萬。溶解血漿中的Hb大分子實(shí)際上是由Hb分子聚集而成的,血漿中溶解的大分子數(shù)目增加使血漿膠體滲透壓增加,而膠體滲透壓增加會(huì)影響組織液的生成及腎臟的濾過作用等,起調(diào)節(jié)血漿滲透壓的作用。⑤
篇5
【關(guān)鍵詞】
糖化血紅蛋白;糖尿病;冠心病
作者單位：214423江蘇省江陰市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院
糖尿病是一種全身性代謝紊亂性疾病，作為冠心病的一個(gè)獨(dú)立的危險(xiǎn)因素，其血管病變是冠心病發(fā)病的基礎(chǔ)，糖尿病患者的心血管疾病的發(fā)病率較非糖尿病者高2～5倍，糖尿病性心臟改變引起死亡者約占糖尿病患者病死率的70％～80％[1]。本文通過對(duì)比我院?jiǎn)渭兲悄虿』颊吲c合并冠心病患者糖化血紅蛋白、及空腹血糖值，旨在探討糖化血紅蛋白與冠狀動(dòng)脈病變的關(guān)系。
1 資料與方法
1.1 一般資料象 127例糖尿病患者均來自2006年 7月至2011年9月我院住院或門診患者，其中經(jīng)冠狀動(dòng)脈造影檢查確診為冠心病69例，冠心病的診斷標(biāo)準(zhǔn)為經(jīng)冠狀動(dòng)脈造影證實(shí)至少有一支心外膜下血管狹窄≥50％；糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《2010年中國(guó)2型糖尿病防治指南診斷標(biāo)準(zhǔn)》。以冠心病合并糖尿病患者69例為觀察組，男32例，女37例，平均年齡(63.2±10.5)歲；選取58例單純血糖增高，無其他器質(zhì)性疾病患者為對(duì)照組，男27例，女31例，平均年齡(62.3±9.9)歲。兩組研究對(duì)象在年齡與性別構(gòu)成比上無統(tǒng)計(jì)學(xué)差別(P>0.05)。
1.2 方法 分別同時(shí)檢測(cè)兩組患者空腹血糖，糖化血紅蛋白，空腹血糖采用葡萄糖氧化酶化法，儀器：日立7170全自動(dòng)生化儀，試劑廠家：上海醫(yī)學(xué)科學(xué)有限公司；糖化血紅蛋白采用免疫抑制透射比濁法，試劑廠家：瑞士Roche公司
1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 14.0，均值比較采用t檢驗(yàn)，以P
2 結(jié)果
觀察組與對(duì)照組空腹血糖與糖化血紅蛋白檢測(cè)值見表1，空腹血糖比較t=2.30，P=0.02，P
3 討論
糖化血紅蛋白是糖尿病診斷2010年1月國(guó)際專家委員會(huì)的一個(gè)新進(jìn)的金標(biāo)準(zhǔn)，將糖化血紅蛋白≥6.5％被作為糖尿病的診斷切點(diǎn)，目前已被臨床醫(yī)生廣泛的應(yīng)用與糖尿病的診斷，因紅細(xì)胞壽命為120 d，糖化血紅蛋白主要反映2~4月內(nèi)血糖的控制水平，空腹血糖、餐后2 h血糖作為長(zhǎng)期糖尿病診斷的標(biāo)準(zhǔn)，有一定的局限性，受患者個(gè)人因素及時(shí)間的受控程度較強(qiáng)，不同時(shí)間測(cè)定波動(dòng)性大，與空腹血糖、餐后2 h血糖相比較糖化血紅蛋白穩(wěn)定性較好[2]。糖化血紅蛋白的檢測(cè)主要應(yīng)用于在糖尿病的早期診斷，尤其對(duì)輕癥、2型、“隱性”糖尿病有提示作用，其次治療過程對(duì)藥物療效的監(jiān)測(cè)評(píng)價(jià)，以及對(duì)血管并發(fā)癥的預(yù)測(cè)[3]。
冠心病的病因復(fù)雜多樣，在充分考慮了年齡、性別、血脂水平及生活習(xí)性(如，吸煙、喝酒等)等多種因素，在分組研究中消除此類因素的組間統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，糖尿病并發(fā)癥的核心問題就是血管的病變，有研究報(bào)道，新診斷的 T2DM 在發(fā)病后 9 年時(shí)，大血管與微血管病變的發(fā)生率分別為 20% 和 9%。大血管病變占所有死亡糖尿病患者原因的 59%，是微血管病變導(dǎo)致死亡的 70 倍[4]。在觀察組與對(duì)照組比較中，空腹血糖P
綜上所述，糖尿病患者糖化血紅蛋白與冠狀動(dòng)脈的病變存在密切的關(guān)系，糖尿病患者糖化血紅蛋白水平的良好控制有利于患者生活質(zhì)量的改善，減少血管并發(fā)癥的發(fā)生率。
參 考 文 獻(xiàn)
［1］ 倪青，呂蕾.糖尿病心血管病的防治.北京：中國(guó)中醫(yī)藥出版社，2003：1.
［2］ 吳志昊，王樹.糖化血紅蛋白在對(duì)糖耐量減退患者血糖水平的評(píng)價(jià).淮海醫(yī)藥，2011，29(1)：21-23.
［3］ 王笠，李琳，王達(dá),等.糖化血紅蛋白的檢測(cè)和臨床應(yīng)用. 上海醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)雜志，2003，18(2)：119-121.
篇6
因素一：血紅蛋白含量正常或偏高，提示體內(nèi)鐵質(zhì)豐富，無需再補(bǔ)鐵。身體內(nèi)缺鐵不行，會(huì)影響血紅蛋白的合成和攜氧能力，造成貧血，阻礙身體各項(xiàng)生理活動(dòng)的正常進(jìn)行。含鐵量高了也不行，會(huì)引起冠狀動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病。
因素二：相對(duì)性增多：由于某些原因使血漿中水分丟失，血液濃縮，使紅細(xì)胞和血紅蛋白含量相對(duì)增多。如連續(xù)劇烈嘔吐、大面積燒傷、嚴(yán)重腹瀉、大量出汗等；另見于慢性腎上腺皮質(zhì)功能減退、尿崩癥、甲狀腺功能亢進(jìn)等。
因素三：由各種原因引起血液中紅細(xì)胞和血紅蛋白絕對(duì)值增多，多與機(jī)體循環(huán)及組織缺氧、血中促紅細(xì)胞生成素水平升高、骨髓加速釋放紅細(xì)胞有關(guān)。
（來源：文章屋網(wǎng) ）
篇7
[關(guān)鍵詞] 糖尿?。惶腔t蛋白；空腹血糖
[中圖分類號(hào)] R446.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B [文章編號(hào)] 2095-0616（2013）15-118-03
Clinical value of detecting HbA1C
JI Guanghou
Department of Clinical Laboratory， the People's Hospital of Sishui County in Shandong Province， Sishui 273200， China
[Abstract] Objective To further explore the clinical value of detecting HbA1C of diabetes mellitus （DM） patients. Methods Glycated hemoglobin A1C （HbA1C） and fasting blood glucose （FBG） were detected respectively by using immunity transmission turbidity and glucose oxidase method. Results HbA1C， FBG in DM group had more significant difference than those in control group （P
[Key words] Diabetes mellitus； HbA1C； FBG
DM是一種需要終身控制的慢性疾病，其慢性并發(fā)癥涉及腎臟、眼、心腦血管和神經(jīng)系統(tǒng)，常導(dǎo)致腦卒中、心肌梗死、下肢壞疽、腎功能衰竭和雙目失明等。我國(guó)目前DM的發(fā)病率呈不斷上升趨勢(shì)，所以，DM的診斷和控制至關(guān)重要。傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)診斷往往以FBG和糖耐量試驗(yàn)作為診斷和治療DM的依據(jù)。但由于血糖測(cè)定結(jié)果是一個(gè)隨機(jī)變量，只代表患者采血瞬間的血糖水平，不能只憑血糖測(cè)定作為評(píng)價(jià)疾病控制狀況的指標(biāo)[1]。因此，GHb檢測(cè)作為DM血糖控制情況和療效評(píng)定的指標(biāo)，正在逐步為臨床所應(yīng)用。為進(jìn)一步了解GHb檢測(cè)對(duì)DM監(jiān)測(cè)控制的臨床價(jià)值，我們對(duì)174例DM患者在治療前后分別進(jìn)行了HbA1C、FBG的聯(lián)合檢測(cè)并總結(jié)分析，現(xiàn)報(bào)道如下。
1 資料與方法
1.1 一般資料
DM組：DM患者195例，均隨機(jī)選取于2009年5月～2012年4月本院收治的、按WHO最新糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)新確診而首次治療的患者，其中男102例，女93例，年齡27～76歲。健康對(duì)照組：健康對(duì)照組180例，為來自排除DM和糖耐量減退的健康體檢者，其中男98例，女82例，年齡29～73歲。DM組和健康對(duì)照組兩組患者，在年齡、性別、病情等方面比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。
1.2 方法
患者組和對(duì)照組均于清晨空腹采取靜脈血兩份，一份以肝素抗凝，用以測(cè)定總Hb（THb）和HbA1C，另一份不抗凝立即分離血清，于2 h內(nèi)測(cè)定FBG；以免疫透射比濁法測(cè)定HbA1C，以葡萄糖氧化酶法測(cè)定FBG，HbA1C結(jié)果按照HbA1C（%）=（HbA1C/THb）×100%公式計(jì)算。
對(duì)新確診而首次治療的195例DM患者，首次檢測(cè)HbA1C和FBG完畢后，剔除21例新發(fā)生的DM（FBG高而HbA1C基本正常）患者，其余174例住院治療或院外觀察治療10周，期間分別在第1、2、3、4、6、8、10周后再重復(fù)測(cè)定HbA1C和FBG 7次，每位DM患者共測(cè)定HbA1C和FBG 8次。對(duì)1次因故不能參加測(cè)定的患者，此后將不再作為檢測(cè)分析對(duì)象。對(duì)HbA1C和FBG結(jié)果不一致的患者，次日和第3天再復(fù)查兩次，以排除初次結(jié)果受到有關(guān)因素影響的偶然性。
1.3 儀器和試劑
儀器為日本Olympus AU640全自動(dòng)生化分析儀，試劑由北京九強(qiáng)公司提供，嚴(yán)格按照儀器操作規(guī)程和試劑說明書進(jìn)行操作。
1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
DM組與健康對(duì)照組計(jì)量數(shù)據(jù)采用（）表示，組間比較采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS13.0進(jìn)行t檢驗(yàn)。P
2 結(jié)果
DM患者組與健康對(duì)照組HbA1C和FBG測(cè)定結(jié)果見表1。171例DM患者在治療后的最后一次（第7次）檢測(cè)中，共有6例HbAlC正常（6例HbAlC皆8.8 mmol/L）；在治療前的195例DM患者中，有3例HbAlC顯著升高但FBG正常。
表1 HbA1C和FBG組間、DM治療前后結(jié)果比較（）
組別 n HbA1C（%） FBG（mmol/L）
DM組治療前 195 9.82±2.18① 10.86±2.61⑴
治療后1周 194 9.79±2.13② 6.38±1.94⑵
治療后2周 192 9.65±2.07③ 6.23±1.72⑶
治療后4周 186 9.41±1.99④ 6.01±1.50⑷
治療后5周 184 8.97±1.95⑤ 5.97±1.47⑸
治療后6周 180 8.33±1.87⑥ 5.84±1.43⑹
治療后8周 176 6.98±1.62⑦ 5.72±1.37⑺
治療后10周 171 6.04±1.55⑧ 5.45±1.34⑻
對(duì)照組 180 5.35±0.86⑨ 4.97±0.90⑼
注：②與①：t=0.14，P>0.5；③與①：t=0.79，P>0.4；④與①：t=1.91，P>0.05；⑤與①：t=3.99，P
3 討論
1968年Rahbar首先證實(shí)DM人的紅細(xì)胞中存在有一種異常的血紅蛋白（Hb），后來證實(shí)此種血紅蛋白即為糖化血紅蛋白（glycosylated hemoglobin，GHb）。成人Hb是由HbA、HbA2、HbF組成（三者分別占Hb總量的97%、2.5%、0.5%）。HbA中包含有HbA1a、HbA1b、HbA1C 3種微量成分，總稱為HbA1（約占8%），即通常所說的GHb。DM時(shí)HbA1C（正常約占5%）顯著升高，HbA1a、HbA1b也有升高，HbA1a、HbA1b、HbA1C的總水平（HbA1）與DM時(shí)血糖控制程度相關(guān)。目前測(cè)定HbA1最基本的方法有兩種：一是將HbA1從HbA中分離出來定量分析；另一種是將HbA1C亞組分分離出來進(jìn)行定量。分離HbA1C比較麻煩費(fèi)時(shí)，以前很少采用，但目前已可以采用免疫分析法來測(cè)定HbA1C[2]，其方法可靠，參考值為4%～6.5%。美國(guó)DM協(xié)會(huì)（ADA）在2002年就將HbA1C的檢測(cè)作為DM療效判定的金標(biāo)準(zhǔn)。亞洲及太平洋地區(qū)2型DM政策組也在2002年制定了DM控制目標(biāo)：FBG7.5%，表明血糖控制不佳，要調(diào)整治療方案[3]。
GHb是指血液中葡萄糖與部分Hb發(fā)生非酶促反應(yīng)所形成的產(chǎn)物，當(dāng)氨基酸與葡萄糖結(jié)合時(shí)形成不穩(wěn)定的希夫氏堿，而后轉(zhuǎn)化成穩(wěn)定的酮化氨基酸。GHb的合成是緩慢和相對(duì)不可逆的，它持續(xù)存在于壽命為120 d的紅細(xì)胞中，合成速率與紅細(xì)胞所處環(huán)境中的血糖濃度成正比，在紅細(xì)胞衰亡前，其含量保持相對(duì)不變。而紅細(xì)胞的半衰期為60 d，因此它在理論上可以反映采血前2個(gè)月左右的平均血糖水平[4]。本研究結(jié)果表明，DM?治療前FBG和HbAlC均明顯高于正常對(duì)照組（P
本研究還顯示，DM在治療前后皆有部分患者FBG與HbAlC結(jié)果不一致，經(jīng)分析有兩種情況。（1）FBG升高而HbAlC基本正常。171例DM患者在治療后的第7次監(jiān)測(cè)中，共有6例患者出現(xiàn)HbAlC正常（皆8.8 mmol/L），導(dǎo)致與近一段時(shí)期FBG平均值不一致，若只將本次FBG作為DM監(jiān)控指標(biāo)，雖有可能早期靈敏地反映糖代謝變化，但也可出現(xiàn)過早或過度干預(yù)治療的傾向，所以，僅憑FBG對(duì)病情預(yù)后和療效評(píng)價(jià)的可靠性較聯(lián)合檢測(cè)HbAlC為低；本資料在篩選病例時(shí)發(fā)現(xiàn)有21例新發(fā)生的DM，亦為只有血糖水平增高但無HbA1C明顯增高的情況。故HbA1C還應(yīng)該與血糖濃度相結(jié)合來診斷DM。（2）FBG正常而HbAlC升高，此時(shí)僅憑FBG測(cè)定不能正確診斷，但檢測(cè)HbAlC再結(jié)合癥狀，?？梢缘玫矫鞔_診斷，本研究通過HbA1C測(cè)定發(fā)現(xiàn)了3例FBG和餐后血糖正常的隱匿性DM。對(duì)于HbA1C特別高而瞬時(shí)血糖正常的DM患者，還應(yīng)警惕和預(yù)防酮癥酸中毒等急性并發(fā)癥的發(fā)生?？傊荒軉为?dú)用HbA1C或血糖來診斷和治療DM，應(yīng)該將HbA1C與血糖濃度相結(jié)合。
GHb的檢測(cè)對(duì)DM并發(fā)癥的預(yù)防有重要意義。有關(guān)研究表明，GHb水平增高會(huì)加大并發(fā)癥（視網(wǎng)膜病變、腎病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等）的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)；反之，如果GHb水平降低將預(yù)示發(fā)生并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)大大降低[5]。GHb對(duì)DM并發(fā)癥有敏感、特異的監(jiān)測(cè)作用，而FBG則不適合作為監(jiān)測(cè)DM腎?。―N）發(fā)生的指標(biāo)[6]。GHb值與2型DM患者的視網(wǎng)膜病變及球結(jié)膜微循環(huán)改變呈明顯的正相關(guān)[7]。GHb增高對(duì)人體的影響是多方面的，它可以改變紅細(xì)胞對(duì)氧的親和力，使組織與細(xì)胞缺氧，加速心腦血管并發(fā)癥的形成。導(dǎo)致組織缺氧可能與微血管病變的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，微血管病變主要表現(xiàn)在視網(wǎng)膜、腎、神經(jīng)、心肌組織，其中尤以DN和視網(wǎng)膜病為重。GHb增高與高血壓及高膽固醇等危險(xiǎn)因素一樣，可以作為預(yù)測(cè)心血管疾病的重要指標(biāo)[8]。同時(shí)，GHb測(cè)定對(duì)預(yù)防DM孕婦的巨大胎兒、畸形胎、死胎，以及急、慢性并發(fā)癥的監(jiān)測(cè)具有重要意義。Silverman等[9]對(duì)618例處于應(yīng)激狀態(tài)的患者行OGTT和HbA1C檢測(cè)研究表明，HbA1C在對(duì)鑒別應(yīng)激高血糖中有重要意義。
總之，F(xiàn)BG測(cè)定結(jié)果只代表采血瞬間的血糖水平，不能單獨(dú)作為評(píng)價(jià)DM的指標(biāo)。GHb的檢測(cè)，是基于GHb自身的化學(xué)特性，即當(dāng)血液中葡萄糖濃度較高時(shí)，人體紅細(xì)胞所形成的GHb含量也會(huì)相應(yīng)增高，在紅細(xì)胞的壽命時(shí)期內(nèi)，血液中GHb含量會(huì)保持相對(duì)不變。而且，GHb的測(cè)定結(jié)果與抽血時(shí)間、患者是否空腹、是否使用胰島素等因素?zé)o關(guān)。因此，GHb測(cè)定可以反映患者測(cè)定前1～2個(gè)月血糖水平的控制情況，是判定DM較長(zhǎng)時(shí)期內(nèi)血糖控制程度和糖代謝總體情況的良好指標(biāo)，與FBG、2 h BG相比具有較明顯的優(yōu)越性[10]。如果能把GHB與瞬時(shí)血糖、動(dòng)態(tài)血糖的監(jiān)測(cè)有機(jī)結(jié)合起來，對(duì)DM的篩查、診斷和鑒別診斷、評(píng)價(jià)DM的控制情況以及并發(fā)癥的預(yù)防具有非常重要的意義。
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篇8
【關(guān)鍵詞】糖尿病 ；糖化血紅蛋白 ；空腹血糖
【中圖分類號(hào)】R-0 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】B 【文章編號(hào)】1671-8801（2015）05-0219-02
糖尿病（DM）是目前臨床上常見的內(nèi)分泌代謝性疾病，是由于胰島素分泌不足導(dǎo)致的以糖代謝紊亂為主的脂肪、蛋白質(zhì)、糖代謝紊亂綜合征，其基本特征是血糖持續(xù)偏高[1]。DM可增加血管疾病如冠心病、心肌梗死等疾病的發(fā)生率，威脅人類的生命健康，降低受試者的生活質(zhì)量，早期的診斷和治療對(duì)延緩疾病的進(jìn)展具有重要作用[2-4]。美國(guó)糖尿病學(xué)會(huì)2010年將糖化血紅蛋白（HbAlc）應(yīng)用于糖尿病的診斷[5]，將HbAlc的診斷標(biāo)準(zhǔn)定為6.5%，從而確定了HbAlc在糖尿病檢查中的重要作用。我科于2015年1月～2015年9月我科對(duì)100例糖尿病患者及健康體檢檢測(cè)HbAlc及空腹血糖，具體分析如下。
1 資料與方法
1.1 一般資料 觀察組50例糖尿病患者，其中男28例，女22例。年齡43～78歲，平均年齡58.5歲；對(duì)照組50例健康體檢人員，其中男26例，女24例。年齡40～75歲，平均年齡59.6歲；兩組觀察對(duì)象在性別、年齡、體重、飲食習(xí)慣等方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。
1.2 檢測(cè)方法 檢測(cè)者空腹12 h后于清晨采集靜脈血5 mL于真空采血管中，采用Olympus AU640全自動(dòng)生化分析儀及配套試劑測(cè)定[6]。另采集靜脈血2 mI，于EDTA-K采血管中，抗凝管中輕輕搖勻，用作HbA1c測(cè)定，采用美國(guó)PRIMUS PDQ離子交換高壓液相色譜分析儀測(cè)定。
1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)數(shù)據(jù)資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用方差分析，計(jì)數(shù)資料采用X2檢驗(yàn)。
2 結(jié)果
觀察組患者空腹血糖及HbAlc檢測(cè)結(jié)果：空腹血糖為12.6±5.2mmol/L，HbA1c10.7±2.8% 。對(duì)照組空腹血糖4.8±1.2mmol/L，HbAlc5.3±0.8%。觀察組空腹血糖及HbAlc均顯著高于對(duì)照組，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P
3 討論
Rahbar在1968～1969年的研究中發(fā)現(xiàn)快速泳動(dòng)的Hb實(shí)際上與HbA1C的結(jié)構(gòu)相同。糖化血紅蛋白是紅細(xì)胞中血紅蛋白與葡萄糖持續(xù)且不可逆地進(jìn)行非酶促蛋白糖基化反應(yīng)的產(chǎn)物。在糖尿病患者中其濃度增加2～3倍，從而確定了HbA1C與糖尿病之間的初步關(guān)系，這與糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生及發(fā)展有密切關(guān)系。HbA1C與空腹血糖、過去數(shù)周的平均血糖水平等有關(guān)。正常人維持一定的血糖水平，就會(huì)形成正常范圍內(nèi)的HbA1C，當(dāng)血糖濃度增加時(shí)，其β鏈上的糖基化位點(diǎn)數(shù)目也增加，據(jù)此HbA1C是判斷血糖控制程度的很好的指標(biāo)。由于HbA1C在檢測(cè)前不穩(wěn)定性很小，生物變異率低，是一項(xiàng)更穩(wěn)定的生物學(xué)指標(biāo)，臨床廣泛采用診斷糖尿病。其壽命與紅細(xì)胞一致。人體內(nèi)紅細(xì)胞的壽命一般為120天，在紅細(xì)胞死亡前，血中HbA1C含量也會(huì)保持相對(duì)恒定。因此，HbA1C水映的是檢測(cè)前120天內(nèi)的平均血糖水平。與采血時(shí)間、是否空腹及使用胰島素等無關(guān)，是判斷糖尿病患者長(zhǎng)期血糖控制好壞的重要指標(biāo)。
總之，臨床HbA1c的測(cè)定的意義有：①作為糖尿病長(zhǎng)期血糖控制的監(jiān)測(cè)，監(jiān)測(cè)治療的療效，尤其在懷疑口服藥物失效而不得不使用胰島素治療時(shí)，HbA1c測(cè)定有較高的價(jià)值；②糖尿病多種慢性并發(fā)癥如糖尿病腎病和視網(wǎng)膜病變的發(fā)生與HbA1c水平密切相關(guān)。并發(fā)現(xiàn)HbA1c7%，則發(fā)生慢性并發(fā)癥的危險(xiǎn)性顯著升高；③用于糖尿病的診斷，有報(bào)道其對(duì)發(fā)現(xiàn)糖尿病的敏感性為85%，特異性為91%。最近Petersd等回顧性研究報(bào)告HbA1c的測(cè)定與WHO糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)密切相關(guān)，且檢測(cè)方便，不必考慮OGTT結(jié)果，僅根據(jù)其測(cè)定值就可做出治療決定。HbA1c≥7%時(shí)需要藥物治療，不管OGTT的診斷是糖耐量降低還是糖尿病，HbA1c
參考文獻(xiàn)：
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篇9
糖尿病患者需要經(jīng)?；?yàn)血糖，根據(jù)血糖監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)來調(diào)整降糖藥物的用量。但是，有些人不知道或者不愿意定期檢驗(yàn)糖化血紅蛋白。其實(shí)，血糖指標(biāo)反映的只是瞬間血糖水平，糖化血紅蛋白才是目前國(guó)際上公認(rèn)的糖尿病監(jiān)控達(dá)標(biāo)的“金標(biāo)準(zhǔn)”。
糖化血紅蛋白是人體血液中紅細(xì)胞內(nèi)的血紅蛋白與血糖結(jié)合的產(chǎn)物，糖化血紅蛋白衡量的是血液慢性糖中毒的情況，可以顯示患者2～3個(gè)月間血糖控制的水平，它不僅能夠衡量患者血糖水平，還可反映血液細(xì)胞中被糖化的蛋白對(duì)患者組織器官傷害的情況。還有研究顯示，穩(wěn)定的糖化血紅蛋白水平可以預(yù)防或者延緩1型和2型糖尿病患者的微血管并發(fā)癥、大血管并發(fā)癥及其他并發(fā)癥。
一般來說，糖化血紅蛋白跟瞬間血糖水平成正比，糖化值越高，表示血糖與血紅蛋白結(jié)合得越多，血糖水平就越高。血糖與血紅蛋白的結(jié)合過程很緩慢，而且是不可逆的，在紅細(xì)胞死亡之前一直存在，每一個(gè)紅細(xì)胞內(nèi)都有血紅蛋白，而紅細(xì)胞的壽命為120天，因此糖化血紅蛋白能夠穩(wěn)定可靠地反映人體內(nèi)最近兩三個(gè)月這“一段時(shí)間”的平均血糖水平。
糖化血紅蛋白正常值為4%～6%，9%為控制差，是慢性并發(fā)癥發(fā)生、發(fā)展的危險(xiǎn)因素，并可能發(fā)生酮癥酸中毒等急性合并癥；>9%說明患者持續(xù)高血糖存在，會(huì)發(fā)生糖尿病腎病、動(dòng)脈硬化、白內(nèi)障等并發(fā)癥，同時(shí)也是心肌梗死、腦卒中死亡的高危因素。
美國(guó)糖尿病協(xié)會(huì)（ADA）建議血糖控制滿意且穩(wěn)定的糖尿病患者至少一年測(cè)2次糖化血紅蛋白；若血糖控制不滿意且需調(diào)整方案者，應(yīng)一年測(cè)4次。計(jì)劃懷孕的糖尿病婦女，初期每月測(cè)1次糖化血紅蛋白，血糖控制滿意后，應(yīng)每6～8周測(cè)1次，直到受孕。2010年最新版《中國(guó)2型糖尿病防治指南》指出：糖化血紅蛋白是反映血糖控制水平的主要指標(biāo)之一。一般情況下，糖化血紅蛋白的控制目標(biāo)應(yīng)小于7%，在調(diào)整治療方案時(shí)，可將糖化血紅蛋白≥7%作為2型糖尿病患者啟動(dòng)臨床治療或需要調(diào)整治療方案的重要判斷標(biāo)準(zhǔn)。因此，指南同時(shí)建議糖尿病患者在治療時(shí)每3個(gè)月檢測(cè)一次糖化血紅蛋白，達(dá)到治療目標(biāo)后可每3～6個(gè)月檢查一次。
篇10
【摘要】 本研究目的是制備鼠抗人血紅蛋白A2（HBA2）單克隆抗體（McAb）并進(jìn)行初步鑒定。將正常人胎肝組織勻漿離心并分離出人胎肝核總蛋白， 用人胎肝核總蛋白免疫BALB/c 小鼠， 采用雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體， 并通過間接ELISA法、Western blot及免疫組織化學(xué)的方法對(duì)單克隆抗體進(jìn)行特異性鑒定， 通過免疫沉淀和UniZAP XR表達(dá)文庫篩選鑒定抗原。結(jié)果表明： 通過間接ELISA篩選獲得分泌AEE091抗體的雜交瘤細(xì)胞1株，其分泌的單克隆抗體Ig亞類（型）為IgG1 (κ)； Western blot 結(jié)果顯示，該抗體識(shí)別分子量為15 kD的蛋白； Western blot識(shí)別AEE091免疫沉淀獲得的分子量為15 kD的抗原；同時(shí)應(yīng)用單克隆抗體AEE091對(duì)人肝臟cDNA表達(dá)文庫（UniZAP XR）進(jìn)行篩選，篩選所獲得的陽性噬菌斑測(cè)序結(jié)果顯示兩個(gè)陽性克隆插入序列均為HBA2。結(jié)論: 經(jīng)篩選獲得了分泌AEE091抗體的雜交瘤細(xì)胞株。AEE091抗體能特異識(shí)別HBA2抗原，因而其在HBA2的功能研究和珠蛋白生成障礙性貧血篩查等方面具有應(yīng)用價(jià)值。
【關(guān)鍵詞】 地中海貧血
Preparation and Identification of Monoclonal Antibody against Homo Sapiens Hemoglobin alpha 2 (HBA2)
Abstract
This study was purposed to prepare and identify monoclonal antibodies (McAbs) against Homo sapiens hemoglobin alpha 2 (HBA2). Normal human fetal liver tissues were homogenized， and human liver nuclear proteins were isolated by centrifugation. The total human fetal liver nuclear proteins were used to immunize BALB/c mice for preparing McAbs by hybridoma technique. The McAbs specificity was identified by ELISA， Western blot， and immunohistochemistry. The antigen was identified by UniZAP expression library screening. The results showed that one hybridoma cell line， AEE091， secreting specific McAb against HBA2 was established. The Ig subclass of this McAb was IgG1 (κ). Data from immunohistochemistry assay showed that AEE091 could recognize human liver nuclear protein. Using AEE091 McAb， isolation of the protein antigen by IP revealed that AEE091 McAb could recognize 15 kD protein. Screening the
UniZAP XR premade liver cDNA library with AEE091 hybridoma cell supernatants demonstrated that AEE091 McAb specially reacted with HBA2. It is concluded that a hybridoma cell line stably secreting specific McAb against HBA2 is established. The specific McAb against HBA2 would be very useful for studying HBA2 function and screening thalassanemia.
Key words
Homo sapiens hemoglobin alpha 2; McAb; cDNA expression library; thalassanemia
J Exp Hematol 2007; 15(4):823-826
血紅蛋白是高等生物體內(nèi)負(fù)責(zé)運(yùn)載氧的一種蛋白質(zhì)。人體內(nèi)的血紅蛋白由4個(gè)亞基構(gòu)成，分別為2個(gè)α亞基和2個(gè)β亞基，血紅蛋白的每個(gè)亞基由1條肽鏈和1個(gè)血紅素分子構(gòu)成，肽鏈在生理?xiàng)l件下會(huì)盤繞折疊成球形，把血紅素分子包在里面，這條肽鏈盤繞成的球形結(jié)構(gòu)又被稱為珠蛋白。珠蛋白生成障礙性貧血(又稱地中海貧血)是由于珠蛋白基因組織的多種突變或缺失，致使珠蛋白合成障礙，正常血紅蛋白不能形成，使紅細(xì)胞易被破壞，壽命縮短。珠蛋白生成障礙性貧血是一種對(duì)人類健康危害較大的遺傳性疾病，在我國(guó)南方較為常見。正常成人紅細(xì)胞所含主要血紅蛋白A(α2β2)由2條α珠蛋白鏈和2條β珠蛋白鏈組成，其余2%-3％是血紅蛋白A2(α2δ2)，2％以下是血紅蛋白F(α2γ2)。珠蛋白生成障礙性貧血的基因突變是異質(zhì)、多態(tài)性的，加之純合子、雜合子的差異，因而有非常不同的表現(xiàn)型?；蛲耆笔Щ蚧蛲蛔兪?種或2種珠蛋白完全不能合成者，稱為α、β或(αβ) 珠蛋白生成障礙性貧血；尚能部分合成者，稱為α+、β+或(αβ)+珠蛋白生成障礙性貧血［1，2］。重型β珠蛋白生成障礙性貧血的HbA2通常減低，也有正常或升高的。輕型β珠蛋白生成障礙性貧血（A2型）的HbA2都輕度增高，HbA2的輕度增高是輕型β珠蛋白生成障礙性貧血的唯一陽性發(fā)現(xiàn)。傳統(tǒng)的HBA2定量需經(jīng)過HB電泳，計(jì)算，需要較長(zhǎng)的時(shí)間且步驟繁瑣［3，4］。因此，制備的HBA2單克隆抗體，可能為珠蛋白生成障礙性貧血的診斷提供一個(gè)快速，經(jīng)濟(jì)和準(zhǔn)確的方法。
材料
免疫和篩選用胎肝核總蛋白，由本室制備。其它主要試劑和儀器包括：弗氏佐劑（Sigma公司產(chǎn)品），羊抗鼠IgGHRP（中山公司產(chǎn)品），蛋白酶抑制劑（Roche公司產(chǎn)品），BCA蛋白定量試劑盒（Pierce公司產(chǎn)品），PVDF膜（Amersham公司產(chǎn)品），ECL反應(yīng)試劑盒（Amersham公司產(chǎn)品），DY89Ⅱ型電動(dòng)玻璃勻漿機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司產(chǎn)品）。
胎肝核總蛋白抗原的制備
胎肝組織以每分鐘700-750轉(zhuǎn)制成勻漿，10克胎肝組織加40 ml勻漿緩沖液，以70900×g蔗糖密度梯度離心90分鐘，離心后取沉淀物，獲得胎肝核總蛋白，應(yīng)用BCA法測(cè)定蛋白濃度。
鼠抗人單克隆抗體的制備
將胎肝核總蛋白1 mg與等體積弗氏完全佐劑混合后進(jìn)行充分乳化，給小鼠多點(diǎn)皮下注射。首次免疫后4周加強(qiáng)免疫1次，1周后經(jīng)尾靜脈取血，分離血清，ELISA法測(cè)定效價(jià)。融合前3天進(jìn)行加強(qiáng)免疫，取免疫小鼠的脾細(xì)胞與X653細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合，采用雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體。
抗原的鑒定
免疫沉淀鑒定抗原 應(yīng)用單克隆抗體從胎肝核總蛋白中免疫沉淀得到相應(yīng)的抗原，并進(jìn)行SDSPAGE電泳和Western blot分析。
篩選UniZAP XR人肝臟cDNA表達(dá)文庫鑒定抗原取大腸桿菌XL1BLUE MRF'過夜培養(yǎng)菌接種于LB培養(yǎng)液中，37℃震蕩培養(yǎng)至OD600為0.7左右， 300×g離心10分鐘，用10 mmol/L的硫酸鎂重懸細(xì)菌沉淀至OD600為0.5，取適當(dāng)稀釋的文庫60 μl（含約50000個(gè)噬菌體）與600 μl重懸的XL1BLUE MRF'混勻后37℃溫育20分鐘，鋪至150 mm的NZYLB平板上，42℃倒置培養(yǎng)至噬菌斑模糊可見，將浸泡過IPTG的NC膜覆蓋表面，37℃繼續(xù)培養(yǎng)3.5小時(shí)，用防水墨水定位后，剝離濾膜，進(jìn)行常規(guī)Dot blot檢測(cè)。在原位板上回收陽性克隆，用ExAssist輔助噬菌體進(jìn)行體內(nèi)剪切、測(cè)序及Western blot分析。
AEE091 單克隆抗體的鑒定
Western blot 分析 胎肝核總蛋白經(jīng)SDSPAGE后，電轉(zhuǎn)至PVDF膜上。用50 g/L脫脂奶粉室溫下封閉1小時(shí)，然后加入AEE091雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清，室溫下孵育2小時(shí)，用TBST緩沖液洗膜后，加入羊抗鼠IgGHRP抗體（1∶5 000稀釋），室溫下孵育1小時(shí)，TBST緩沖液洗膜后，用ECL法顯色。
免疫組織化學(xué)鑒定 用丙酮固定的冰凍胎肝組織切片，用PBST浸洗5分鐘后每個(gè)組織片滴加25 mg/L的親合素（avidin) 50 μl，室溫孵育15分鐘，滴加3% H2O2甲醇，室溫孵育15分鐘。滴加正常羊血清室溫下封閉30分鐘，加入雜交瘤AEE091的培養(yǎng)上清液，4℃孵育過夜。用PBS洗片后加入羊抗鼠IgGHRP，37℃孵育30分鐘，用PBS洗片后進(jìn)行DAB顯色，蘇木素復(fù)染，返藍(lán)后封片。
結(jié)
果
胎肝核總蛋白抗原
胎肝組織勻漿經(jīng)70900×g蔗糖密度梯度離心沉淀，獲得了胎肝核總蛋白 80 mg。
鼠抗人單克隆抗體
應(yīng)用細(xì)胞融合、ELISA間接篩選和克隆化，獲得了鼠抗人胎肝核總蛋白陽性抗體AEE091，其亞類（型）為IgG1(κ)。
抗原的鑒定
Western blot和免疫沉淀鑒定 Western blot 結(jié)果表明，AEE091 McAb識(shí)別該分子量為15 kD的蛋白（圖1）。應(yīng)用AEE091 McAb從胎肝核總蛋白中免疫沉淀，得到相應(yīng)的抗原，經(jīng)SDSPAGE電泳和Western blot 分析表明，AEE091 McAb免疫沉淀得到了分子量為15 kD的蛋白。
篩選UniZAP XR人肝臟cDNA表達(dá)文庫鑒定抗原 用獲得的AEE091的細(xì)胞培養(yǎng)上清對(duì)人肝臟cDNA表達(dá)文庫進(jìn)行第一輪的篩選，得到了陽性噬菌斑4個(gè)（圖2 A）。取陽性噬菌斑進(jìn)行第2輪篩選，得到了單克隆的陽性噬菌斑10個(gè)（圖2 B）。分離2個(gè)獨(dú)立的陽性克隆進(jìn)行體內(nèi)剪切并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌中，將得到的陽性克隆進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，菌體蛋白經(jīng)Western blot鑒定，AEE091 McAb能識(shí)別分子量為15 kD的表達(dá)蛋白。測(cè)序結(jié)果表明，陽性克隆插入基因起始位置為HBA2的前導(dǎo)肽，距起始密碼子ATG10bp（圖3）。因此，陽性克隆的AEE091識(shí)
別的蛋白為HBA2，并推定陽性克隆中插入的基因?yàn)镠BA2的全長(zhǎng)。
AEE091單克隆抗體的免疫組織化學(xué)鑒定
免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，鼠抗人HBA2 單克隆抗體AEE091識(shí)別的抗原主要定位于胎肝細(xì)胞核中（圖4）。
討
論
本研究在制備抗HBA2單克隆抗體中并沒有采用將已知抗原HBA2免疫動(dòng)物獲得相應(yīng)單克隆抗體這樣的傳統(tǒng)路線，而是采用通過胎肝核總蛋白混合免疫小鼠，得到多株單克隆抗體，然后將這些抗體進(jìn)行進(jìn)一步的鑒定，篩選人肝臟cDNA表達(dá)文庫，確定其相應(yīng)抗原的方法，成功地制備出了抗HBA2的單克隆抗體。因?yàn)槊庖咚玫目乖翘烊坏牡鞍祝ㄟ^這種方法制備的抗體具有識(shí)別天然蛋白的特征，有利于抗體的進(jìn)一步應(yīng)用。采用該方法制備抗體效率高，可以在短時(shí)間內(nèi)制備大量的針對(duì)不同抗原的單克隆抗體，通過Western blot分析單克隆抗體AEE091，表明其具有很好的特異性。應(yīng)用該抗體進(jìn)行免疫沉淀，可以得到相應(yīng)的抗原，該抗原正是免疫所用的天然蛋白抗原。應(yīng)用單克隆抗體AEE091對(duì)人肝臟cDNA表達(dá)文庫進(jìn)行篩選，所獲得的2個(gè)陽性克隆經(jīng)過測(cè)序，比對(duì)，最終鑒定AEE091所識(shí)別的抗原為HBA2。免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，單克隆抗體AEE091識(shí)別的抗原HBA2定位于胎肝臟細(xì)胞核中。岳秀玲等［5］應(yīng)用抗血紅蛋白的抗體檢測(cè)尿中血紅蛋白，結(jié)果顯示單克隆抗體檢測(cè)疾病具有靈敏度高，特異性好的特點(diǎn)，因此所制備的抗HBA2抗體AEE091將成為研究HBA2的有利工具。
參考文獻(xiàn)
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