導(dǎo)語(yǔ)：如何才能寫好一篇纖維素酶，這就需要搜集整理更多的資料和文獻(xiàn)，歡迎閱讀由公務(wù)員之家整理的十篇范文，供你借鑒。

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關(guān)鍵詞：木質(zhì)纖維素；纖維素酶；纖維素酶解

DOI：10.16640/ki.37-1222/t.2017.10.185

1 引言

木質(zhì)纖維素原料來(lái)源十分廣泛，是儲(chǔ)量豐富的可再生資源[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球每年生產(chǎn)該類物質(zhì)約200×109噸，其中有90%以上是木質(zhì)纖維素類物質(zhì)，而它們當(dāng)中有8～20×109仍具有潛在的可利用性[2]。包括農(nóng)業(yè)廢棄物（秸稈、蔗渣等）如何處理，對(duì)環(huán)境壓力以及可再生能源的利用具有現(xiàn)實(shí)意義。因此，在生物燃料、生物基化學(xué)品、分子材料、食品等領(lǐng)域這些廉價(jià)及豐富的木質(zhì)纖維素，都具有廣泛的應(yīng)用空間。

纖維素的結(jié)構(gòu)單位時(shí)D-葡萄糖，其分子式為：（C6H10O5）n，式中n為葡萄糖基數(shù)目，稱為聚合度。經(jīng)長(zhǎng)期研究，已證實(shí)天然纖維素中D-葡萄糖基以吡喃環(huán)的形式存在，并且相互以β-1，4糖苷鍵構(gòu)成分子鏈，因?yàn)檫@對(duì)吡喃式D-葡萄糖具有最低的能態(tài)，這也是其二聚物（纖維二糖）及共衍生物的真正形式。由于葡萄糖上帶有多個(gè)羥基，因此纖維素分子間容易形成氫鍵，進(jìn)而使得鏈與鏈之間氫鍵緊密連接易于聚集成結(jié)晶性的原纖結(jié)構(gòu)。如圖1所見，大量氫鍵網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中存在著相對(duì)規(guī)則的結(jié)晶區(qū)，其阻礙了纖維素分子的進(jìn)一步利用，故纖維素水解前需進(jìn)行預(yù)處理，破壞它的氫鍵及結(jié)晶區(qū)，以便更好地水解纖維素，從而增加它的酶可及面積。

2 纖維素酶作用機(jī)理

纖維素酶是指能夠水解纖維素β-1，4-糖苷鍵，進(jìn)而生成葡萄糖的一類酶的總稱，它是由幾種酶共同協(xié)同作用，而不是單一的酶，其中主要包括外切葡聚糖酶（CBH，C1）、內(nèi)切葡聚糖酶（EG，Cx）和β-葡萄糖苷酶（CB，纖維二糖酶）。長(zhǎng)期的研究表明，結(jié)晶纖維素的徹底降解至少需要這3組纖維素酶的協(xié)同作用，如圖2所示，Cx能容易地降解接近類型的纖維素或衍生物，Cx只有和C1組分結(jié)合時(shí)才可以利用晶形式的纖維素。C1酶首先作用于結(jié)晶纖維素表面，使其形成結(jié)晶構(gòu)的纖維素鍵斷開，長(zhǎng)鏈分子末端游離，從而其轉(zhuǎn)化成可被Cx酶作用的形式，Cx酶水解非結(jié)晶或纖維素、可溶性纖維素轉(zhuǎn)化為纖維二糖，最后由β-葡萄糖苷酶將纖維二糖、三水解為葡萄糖。

3 單一纖維素組分作用機(jī)理

（1）內(nèi)切葡聚糖酶（EG或Cx）。Cx酶作用于纖維素的β-1，4葡萄糖苷鍵，隨機(jī)切割，產(chǎn)生大量纖維素的還原性末端。測(cè)定Cx酶活力方法較多，通用的方法是利用羧甲基纖維素鈉（CMC）作為底物測(cè)其酶活，由于它是一種高聚合度的可溶性纖維素衍生物，還原性所占比例較少，纖維素酶易于作用β-1，4葡萄糖苷鍵。

（2）外切葡聚糖酶（CBH，C1）。C1酶是指切割有Cx酶所產(chǎn)生的纖維素分子還原性末端，能夠是纖維素長(zhǎng)鏈釋放出葡萄糖及小分子的寡糖。

有研究表明，已知外切葡聚糖酶具有2個(gè)獨(dú)立的活性結(jié)構(gòu)域：其一是指具有催化纖維素功能的結(jié)構(gòu)域CD，其二是指具有結(jié)合纖維素功能的結(jié)合于CBD，二者由高度糖基化鏈相連接。查閱大量文獻(xiàn)指出，C1對(duì)纖維素結(jié)晶區(qū)破壞作用極大，能夠產(chǎn)生纖維二糖。其原因是首先是利用CBD把C1吸附在纖維素結(jié)晶區(qū)表面，其次再由單根葡聚糖鏈（纖維素）快速準(zhǔn)確地進(jìn)入CD中帶底物結(jié)合和催化部位的“隧道”，纖維二糖被準(zhǔn)確地從葡聚糖鏈上切割下來(lái)并被釋放出來(lái)的同時(shí)，C1分子沿著葡聚糖鏈向前滑動(dòng)2個(gè)葡萄糖單位[3]。

（3）β-葡萄糖苷酶（CB，纖維二糖）。CB酶又稱β-D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶，它能夠作用于結(jié)合在末端非還原性的β-D-葡萄糖苷鍵，水解生成部分β-D-葡萄糖以及相應(yīng)的配基。在水相系統(tǒng)中，CB酶能水解纖維二糖及一些聚合度小于6的纖維糊精為葡萄糖，隨著聚合度的增加，水解效果顯著下降。

4 總結(jié)

木質(zhì)纖維素廣泛的來(lái)源，如農(nóng)業(yè)廢棄物、餐廚垃圾以及部分工業(yè)殘余物等，可通過(guò)預(yù)處理和水解發(fā)酵轉(zhuǎn)化為能源物質(zhì)。在此基礎(chǔ)上，需要在理論研究做出深入解釋，以便更好的應(yīng)用于實(shí)踐。

參考文獻(xiàn)：

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關(guān)鍵詞 米曲霉；固態(tài)發(fā)酵；纖維素酶活

中圖分類號(hào) S147.4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-5739（2016）08-0197-02

Abstract The culture conditions affected the production of cellulose enzyme by Aspergillus oryzae，such as carbon source，nitrogen source，initial pH，water content，culture temperature，culture time，etc.The results showed that when the carbon source was bran，nitrogen source was powder of bean cake，initial pH value was 6.5，moisture content was 50%，culture temperature was 30 ℃，training time was 60 h，the cellulose enzyme activity produced by Aspergillus oryzae was the highest.

Key words Aspergillus oryzae；solid-state fermentation；cellulose enzyme activity

我國(guó)農(nóng)作物秸稈的利用率普遍很低，多數(shù)作物秸稈都作焚燒處理，對(duì)環(huán)境的污染很大。作物秸稈中含有豐富的有機(jī)質(zhì)、氮、磷、鉀等作物生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)元素，如果能得到合理的利用，將會(huì)為人類帶來(lái)巨大的收益。作物秸稈的處理方式有物理、化學(xué)、生物方法，其中生物降解具有污染少、能耗低等優(yōu)點(diǎn)[1]。作物秸稈中含有豐富的纖維素，纖維素在纖維素酶的作用下可以水解生成單糖被作物和微生物利用，但纖維素不易被降解，幾十年來(lái)，人們對(duì)于纖維素的預(yù)處理及酶水解過(guò)程進(jìn)行了大量研究，其中纖維素酶的使用大大提高了纖維素的降解率[2]。

米曲霉屬半知菌亞門絲孢綱絲孢目從梗孢科曲霉屬真菌中的一個(gè)常見種。米曲霉（Aspergillus oryzae）是纖維素酶的主要生產(chǎn)菌種之一。工業(yè)用米曲霉菌種所產(chǎn)的酶系較多、酶系組成較復(fù)雜[3]，國(guó)內(nèi)對(duì)該菌株的相關(guān)研究并不多，對(duì)其酶系在工業(yè)發(fā)酵過(guò)程中受到的影響因素及其作用機(jī)理并不十分了解，從而導(dǎo)致在工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中不能夠十分精確地控制米曲霉的產(chǎn)酶過(guò)程，限制了這一傳統(tǒng)的食用菌株在工業(yè)應(yīng)用領(lǐng)域的進(jìn)一步拓展[4]。本試驗(yàn)對(duì)米曲霉M1102產(chǎn)纖維素酶在固體發(fā)酵過(guò)程中所受的影響及活性變化進(jìn)行了研究，以期為米曲霉產(chǎn)纖維素酶的工業(yè)化生產(chǎn)提供相關(guān)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 菌種。米曲霉菌株M1102，來(lái)自中國(guó)菌種保藏中心。

1.1.2 培養(yǎng)基與主要試劑。斜面培養(yǎng)基：土豆培養(yǎng)基（PDA）；液體種子培養(yǎng)基：豆餅粉5 g/L，蛋白胨5 g/L，蔗糖10 g/L，MgSO4 0.3 g/L，K2HPO4 0.3 g/L，調(diào)節(jié)pH值至7.0；營(yíng)養(yǎng)鹽溶液：NaCl 2 g/L、KH2PO4 1.5 g/L、CaCO3 0.5 g/L、MgSO4 0.5 g/L，調(diào)節(jié) pH值至7.0；固體培養(yǎng)基：木質(zhì)纖維素培養(yǎng)基；主要試劑：麩皮、稻殼粉、玉米粉、玉米芯粉、葡萄糖、蔗糖、豆餅粉、干酪素、蛋白胨、硫酸銨、尿素。

1.1.3 儀器設(shè)備。酒精燈、接種環(huán)、超凈工作臺(tái)、高壓蒸汽滅菌鍋、pH測(cè)定儀、紫外分光光度計(jì)、水浴鍋、恒溫培養(yǎng)箱、電子天平、控溫?fù)u床。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)方法。一是米曲霉種子液制備：將米曲霉接種于PDA斜面上進(jìn)行活化，用接種環(huán)挑取一環(huán)接種于250 mL三角瓶的種子液中，裝液量為50 mL，30 ℃，180 r/min，培養(yǎng)24 h。二是固體培養(yǎng)：在250 mL三角瓶中加入10 g風(fēng)干后過(guò)篩的木質(zhì)纖維原料和5 mL營(yíng)養(yǎng)鹽溶液，拌勻，121 ℃滅菌30 min，冷卻后將種子液以3%的接種量接種于固體培養(yǎng)基中，32 ℃下培養(yǎng)60 h，測(cè)定其產(chǎn)纖維素酶活[5]。粗酶液的制備：每1g固態(tài)培養(yǎng)物加入磷酸緩沖溶液5.0 mL（pH值 7.2），室溫下浸提1 h，10 000 r/min離心10 min，上清液即為粗酶液。

1.2.2 培養(yǎng)條件的優(yōu)化。一是碳源對(duì)纖維素酶活的影響：分別用3%含量的麩皮、稻殼粉、玉米粉、玉米芯粉、葡萄糖、蔗糖作為培養(yǎng)基的碳源，其他成分同初始培養(yǎng)基，培養(yǎng)結(jié)束后測(cè)定其纖維素酶含量[6]。二是氮源對(duì)纖維素酶活的影響：分別以2%的豆餅粉、干酪素、蛋白胨、硫酸銨、尿素作為培養(yǎng)基的氮源，其他成分同初始培養(yǎng)基，培養(yǎng)結(jié)束后測(cè)定培養(yǎng)基中纖維素酶含量[6]。三是發(fā)酵條件優(yōu)化：采用優(yōu)化后的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基，在固定其他發(fā)酵條件的基礎(chǔ)上，逐一對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)的初始pH值、培養(yǎng)基含水量、培養(yǎng)時(shí)間、發(fā)酵溫度等培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化。

1.2.3 纖維素酶活的測(cè)定方法。采用GB-羧甲基纖維素法（CMC法）。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基碳源對(duì)纖維素酶活力的影響

酶誘導(dǎo)物和酶蛋白質(zhì)前體同時(shí)對(duì)纖維素酶的合成有調(diào)控作用，酶誘導(dǎo)物一般為可利用的碳源，纖維素作為酶誘導(dǎo)物對(duì)纖維素酶的產(chǎn)生有重要作用。從圖1可以看出，在培養(yǎng)基其他基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)成分不變的前提下，改變碳源含量后，米曲霉產(chǎn)纖維素酶活發(fā)生顯著變化，其中碳源為麩皮時(shí)纖維素酶活最高；稻殼粉和玉米芯粉次之，為最高酶活的72%和68%；玉米粉和蔗糖為最高酶活的60%和37%；碳源為葡萄糖時(shí)纖維素酶活最低，僅為最高酶活的30%。當(dāng)碳源中纖維素含量豐富時(shí)，米曲霉產(chǎn)纖維素酶活力高，這是由于纖維素作為酶誘導(dǎo)物能刺激纖維素酶的產(chǎn)生，將其分解為可利用的單糖，而葡萄糖和蔗糖作為碳源時(shí)，米曲霉能直接利用其作為碳源，所以抑制了纖維素酶的產(chǎn)生。

2.2 培養(yǎng)基氮源對(duì)纖維素酶活力影響

氮源是酶蛋白質(zhì)前體的主要來(lái)源，因此氮源的類型和性質(zhì)同樣會(huì)影響纖維素酶的合成和分泌。選擇不同氮源作為單一氮源進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，來(lái)考察其對(duì)米曲霉產(chǎn)酶的影響。

從圖2可以看出，在試驗(yàn)選用的5種有機(jī)和無(wú)機(jī)氮源中，以豆餅粉作為氮源時(shí)米曲霉所產(chǎn)纖維素酶活性最高；干酪素和蛋白胨次之，纖維素酶活是豆餅粉作為單一氮源時(shí)活性的96%和81%；當(dāng)分別以硫酸銨和尿素為單一氮源時(shí)，米曲霉所產(chǎn)纖維素酶活性僅為最高酶活性的70%和68%。由此表明，有機(jī)氮源對(duì)纖維素酶活的影響大于無(wú)機(jī)氮源，這可能與有機(jī)氮源中營(yíng)養(yǎng)成分含量多元化有關(guān)。

2.3 培養(yǎng)基初始pH值對(duì)纖維素酶活力的影響

微生物在生長(zhǎng)繁殖和代謝過(guò)程中，由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被分解利用和代謝產(chǎn)物的形成與積累，導(dǎo)致培養(yǎng)基pH值發(fā)生變化，而培養(yǎng)基初始pH值不僅影響微生物的生長(zhǎng)繁殖，且對(duì)其產(chǎn)酶情況有顯著的影響。在優(yōu)化培養(yǎng)基碳氮源基礎(chǔ)上，調(diào)節(jié)初始pH值為4.0～9.0來(lái)考察米曲霉產(chǎn)酶活性的變化。從圖3 可以看出，米曲霉產(chǎn)生纖維素酶的最佳初始pH 值為6.0～7.5，當(dāng)培養(yǎng)基初始pH值為5.5，米曲霉仍能產(chǎn)生相對(duì)于最高活性 72%的纖維素酶；而當(dāng)培養(yǎng)基初始pH值調(diào)至8.0 時(shí)，米曲霉產(chǎn)生纖維素酶活性則迅速下降至最高酶活性的34%。試驗(yàn)表明米曲霉產(chǎn)纖維素酶的pH值適應(yīng)范圍較寬，但過(guò)酸或過(guò)堿的環(huán)境不利于纖維素酶的生產(chǎn)。這可能是由于過(guò)酸或過(guò)堿的環(huán)境不利于米曲霉生長(zhǎng)或破壞了纖維素酶活力。

2.4 培養(yǎng)基含水量對(duì)纖維素酶活力的影響

水分是微生物生長(zhǎng)代謝的重要物質(zhì)，在固體發(fā)酵中，水分對(duì)微生物活性有重要影響。從圖4可以看出，隨著培養(yǎng)基中含水量的增加，米曲霉產(chǎn)纖維素酶活呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢(shì)，當(dāng)培養(yǎng)基含水量為50%時(shí)，纖維素酶活最高。所以含水量過(guò)高或過(guò)低都會(huì)抑制米曲霉生長(zhǎng)，這可能是由于低水分使米曲霉培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)溶解性降低，抑制了米曲霉生長(zhǎng)；當(dāng)水分含量過(guò)高時(shí)，培養(yǎng)基過(guò)于黏稠，破壞了培養(yǎng)基的多孔結(jié)構(gòu)，降低了其透氣性，而米曲霉是耗氧微生物，低氧環(huán)境不利于其生長(zhǎng)。

2.5 培養(yǎng)溫度對(duì)纖維素酶活力的影響

微生物最適宜的溫度范圍一般為16～30 ℃，最高溫度在37～43 ℃，溫度過(guò)高或過(guò)低均不利于米曲霉生長(zhǎng)。從圖5可以看出，在30～35 ℃時(shí)，纖維素酶活最高，溫度過(guò)低或過(guò)高都會(huì)降低纖維素酶活。這是由于，當(dāng)溫度過(guò)低時(shí)，米曲霉生

長(zhǎng)緩慢導(dǎo)致產(chǎn)生纖維素酶少，而且低溫環(huán)境會(huì)降低酶活力；當(dāng)溫度過(guò)高時(shí)，米曲霉會(huì)由于高溫而出現(xiàn)老化現(xiàn)象，抑制了纖維素酶產(chǎn)生，并且高溫容易使纖維素酶失活。

2.6 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)纖維素酶活力的影響

微生物處于不同的生長(zhǎng)期時(shí)，其相應(yīng)的生長(zhǎng)代謝機(jī)理也不同。從圖6可以看出，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，米曲霉產(chǎn)纖維素酶活呈先升高后降低的趨勢(shì)。當(dāng)培養(yǎng)至60 h時(shí)，纖維素

酶活最高。這是由于培養(yǎng)初期米曲霉處于繁殖階段，產(chǎn)生孢子數(shù)量有限，故分泌的纖維素酶少；而在培養(yǎng)后期，由于米曲霉出現(xiàn)老化，導(dǎo)致纖維素酶分泌量減少。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)研究了米曲霉菌株M1102在不同固體發(fā)酵條件下產(chǎn)纖維素酶的變化。結(jié)果表明：當(dāng)碳源為麩皮，氮源為豆餅粉，初始pH值為6.5，含水量為50%，培養(yǎng)溫度為30 ℃，培養(yǎng)時(shí)間為60 h時(shí)，米曲霉產(chǎn)纖維素酶活力最高。為了深入了解米曲霉固體發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的影響因素，還需要對(duì)纖維素酶的生產(chǎn)條件和作用機(jī)理做更深一步的研究。

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1.1葡萄糖內(nèi)切酶

該酶作用于纖維素分子內(nèi)的非結(jié)晶區(qū)，隨機(jī)水解β-1，4-糖甘鍵，截短長(zhǎng)鏈纖維素分子，產(chǎn)生許多帶有非還原性末端的小分子纖維素，但不能單獨(dú)作用于結(jié)晶的纖維素。同時(shí)它也能水解小分子的纖維寡糖。

1.2葡萄糖外切酶

這類酶作用于纖維素分子的末端，依次切下纖維素分子中的纖維二糖，可作用于纖維素分子內(nèi)的結(jié)晶區(qū)、無(wú)定形區(qū)和羧甲基纖維素。

1.3β-葡萄糖苷酶

也稱纖維二糖酶，是一種可將纖維二糖、纖維三糖和纖維六糖等水解為葡萄糖的非專一性酶；在水解過(guò)程中低聚糖對(duì)外切酶和內(nèi)切酶的產(chǎn)物產(chǎn)生抑制作用，這種酶的存在可以顯著降低抑制作用，提高水解效率。

2食品工業(yè)纖維素酶的來(lái)源

纖維素酶的來(lái)源非常廣泛，昆蟲、動(dòng)物體、微生物（細(xì)菌、放線菌、真菌、酵母）等都能產(chǎn)生纖維素酶。由于動(dòng)物體和放線菌的纖維素酶產(chǎn)量極低，所以很少研究。細(xì)菌所產(chǎn)生的酶是胞內(nèi)酶，或者吸附在菌壁上，很少能分泌到細(xì)胞外，提取純化的難度大。而且產(chǎn)量也不高，主要是中性和堿性的葡萄糖內(nèi)切酶。因其多數(shù)對(duì)結(jié)晶纖維素沒(méi)有活性，所以主要用于棉織品水洗整理工藝及洗滌劑工業(yè)中，在食品工業(yè)中應(yīng)用也較少[4]。目前，報(bào)道較多的是真菌，其產(chǎn)生的纖維素酶通常是胞外酶，酶一般被分泌到培養(yǎng)基中，用過(guò)濾和離心等方法就可較容易地得到無(wú)細(xì)胞酶制品。絲狀真菌產(chǎn)生的纖維素酶一般在酸性或中性偏酸性條件下水解纖維素底物，其中木霉纖維素酶產(chǎn)量高、酶系全，故而被廣泛應(yīng)用，尤其是里氏木霉、綠色木霉的研究較多。

2.1產(chǎn)纖維素酶里氏木霉的研究進(jìn)展

由于里氏木霉產(chǎn)纖維素酶量高、穩(wěn)定性好、適應(yīng)性強(qiáng)，便于生產(chǎn)和管理，因此具有突出的研究和利用價(jià)值。目前，在菌株選育上普遍采用人工誘變和基因工程改造兩種方案獲得高效分解纖維素的菌株。誘變的方法一般是傳統(tǒng)的物理誘變(紫外線)和化學(xué)誘變(亞硝基胍)。IKEM等以里氏木霉ATCC66589為出發(fā)菌株，經(jīng)紫外線誘變，獲得兩株突變菌株M2-1和M3-1。其濾紙酶活分別達(dá)到257U和281U。張素敏等利用紫外線誘變里氏木霉T306，得到突變菌株的CMCA活力達(dá)到64.2U/mL[5]。在化學(xué)誘變劑中，烷化劑可與巰基、氨基和羧基等直接反應(yīng)，故更易誘發(fā)基因突變。DURANDH等用亞硝基胍誘變里氏木霉QM9414，得到一株穩(wěn)定性較好的突變菌株CL847，F(xiàn)PA酶活最高達(dá)到5.2U/mL，較出發(fā)菌株提高了4倍[6]。也有紫外線與亞硝酸鈉、亞硝基胍等化學(xué)試劑復(fù)合誘變的研究，取得了較好的效果。這些研究對(duì)里氏木霉高產(chǎn)纖維素酶菌株的選育及其工業(yè)化應(yīng)用具有顯著意義?；蚬こ谈脑炜梢詮牟煌a(chǎn)纖維素酶菌株中篩選出比活力高、酶學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定的基因重組在一起并高效表達(dá)，具有定向性，是選育出高產(chǎn)纖維素酶菌株的有效途徑。目前已成功在里氏木霉中克隆表達(dá)的基因有纖維二糖酶基因、celEn、pBGL1、af211、Neg[7]。

2.2產(chǎn)纖維素酶綠色木霉的研究進(jìn)展

綠色木霉酶活較大，是目前公認(rèn)較好的纖維素酶生產(chǎn)菌。目前的研究主要集中于綠色木霉產(chǎn)纖維素酶生產(chǎn)工藝的研究。陳莉等采用固態(tài)發(fā)酵方法研究了不同條件對(duì)其產(chǎn)纖維素酶活的影響。得出綠色木霉固態(tài)產(chǎn)酶發(fā)酵的最優(yōu)條件是培養(yǎng)溫度30℃，培養(yǎng)時(shí)間5d，接種量5%，含水量250%。在實(shí)際發(fā)酵過(guò)程中，不同的酶組分達(dá)到最大酶活的時(shí)間也有不同，例如FPA酶活在發(fā)酵2d后達(dá)到最高值,Cx酶活在發(fā)酵3d后達(dá)到最高值。以蛋白胨為唯一氮源時(shí)，纖維素酶活力最高，以尿素為唯一氮源時(shí)，纖維素酶活力最低。綠色木霉分泌的酶系偏酸性,發(fā)酵液初始pH值為4.5時(shí)，F(xiàn)PA酶活和Cx酶活都出現(xiàn)最高值。因此在實(shí)際應(yīng)用中也可以根據(jù)需要來(lái)調(diào)整不同酶組分的含量，以及合適的氮源，適宜的pH值等[8-9]。黃發(fā)等人對(duì)綠色木霉產(chǎn)β-葡聚糖酶的工藝條件研究也得出了類似的結(jié)果[10]。

3纖維素酶在食品工業(yè)的應(yīng)用

3.1在果蔬加工中的應(yīng)用

在果蔬的加工過(guò)程中,為了使得植物組織快速軟化和膨潤(rùn),常常采用加熱蒸煮或酸堿處理等方法。這樣一來(lái)就使得蔬菜、果實(shí)的香味和維生素等損失很大。通過(guò)使用纖維素酶來(lái)進(jìn)行蔬菜的軟化可以避免這一缺點(diǎn)。除此以外,通過(guò)采用纖維素酶對(duì)蔬菜和果實(shí)進(jìn)行分解,可以使加工的果醬口感增加;還可以用纖維素酶來(lái)分解蘑菇,制造一種很好的調(diào)味料;在糖果品加工工藝中也可以采用纖維素酶來(lái)縮短砂糖進(jìn)入果實(shí)當(dāng)中的時(shí)間，以更快地達(dá)到浸透效果[11]。朱莉莉等研究了羊棲菜汁浸提工藝條件,通過(guò)研究最適范圍各個(gè)單因素發(fā)現(xiàn)，在復(fù)合酶酶解提取羊棲菜汁的最佳浸提方案中,添加纖維素酶與果膠酶配比3:2可以大大提高浸提率[12]。

3.2在大豆加工中的應(yīng)用

纖維素酶用于對(duì)大豆的處理,可以促使其大豆快速脫皮,與此同時(shí),由于纖維素酶可以破壞其細(xì)胞壁,從而使得包含在細(xì)胞中的油脂和蛋白質(zhì)完全的分離開來(lái),導(dǎo)致大豆和豆餅中提取優(yōu)質(zhì)的水溶性蛋白質(zhì)和油脂的得率明顯增加，不但降低了生產(chǎn)成本，而且還顯著地縮短了生產(chǎn)時(shí)間,更是提高了生產(chǎn)產(chǎn)品的品質(zhì)。

3.3在茶葉加工中的應(yīng)用

隨著茶飲料工業(yè)的快速發(fā)展，茶水飲料生產(chǎn)的方式漸漸地由最初飲料廠的全程生產(chǎn)方式向由原料廠商只是生產(chǎn)茶濃縮汁這一方式過(guò)度,這就使得我國(guó)的茶葉濃縮汁、速溶茶等生產(chǎn)發(fā)展快速。隨著近現(xiàn)代生物技術(shù)的快速發(fā)展,外源的生物酶在茶葉提取、加工中得到充分的應(yīng)用。酶法提取的原理為利用其纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶等水解酶分解茶葉的細(xì)胞壁,使得細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞,導(dǎo)致茶葉中的有效成分快速擴(kuò)散與浸出,有利于提高固形物的溶出和浸提率。在茶葉提取生產(chǎn)的過(guò)程中，纖維素酶可以提升其可溶性糖類的含量以及水浸出物得率，并且還可以促進(jìn)氨基酸、茶多酚、咖啡堿等物質(zhì)的溶出，有利于釋放出芳香性物質(zhì)，有顯著的增香效果[13]。

4纖維素酶在釀造、發(fā)酵工業(yè)中的應(yīng)用

4.1在醬油、食醋釀造中的應(yīng)用

醬油釀造主要是利用蛋白酶及淀粉酶等酶類對(duì)原料進(jìn)行相應(yīng)的酶解，而在該過(guò)程中如果添加使用纖維素酶，就可以使大豆等原料的細(xì)胞膜軟化、膨脹等細(xì)胞破壞作用更加明顯，使得包藏在細(xì)胞中的碳水化合物、蛋白質(zhì)等順利釋放，從而縮短釀造時(shí)間，并且可以顯著提高產(chǎn)率及品質(zhì)，使醬油中的還原糖和色度明顯增加，風(fēng)味得到明顯改善[14]。在食醋釀造過(guò)程中，通過(guò)纖維素酶與糖化酶混合使用，可以顯著提升原料利用率及出品率。郝建新等以綠原酸為評(píng)價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行了添加纖維素酶發(fā)酵醋的工藝研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，利用纖維素酶等酶后，得到的發(fā)酵醋色澤澄清，并具備醋特有的香氣，口感也很柔和，而且具有比較好的體外抗氧化的效果[15]。

4.2在啤酒加工過(guò)程中的應(yīng)用

把纖維素酶利用在啤酒工業(yè)的麥芽生產(chǎn)當(dāng)中，可以增加麥粒等的溶解性，減少糖化液中R-葡萄糖的含量，明顯提高過(guò)濾性能。張麟等對(duì)啤酒糟進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)預(yù)處理過(guò)程中添加纖維素酶水解比只用機(jī)械處理得到的可溶性糖含量有明顯提高[16]。

4.3在飲料中的應(yīng)用

馮丹等用新鮮的豆渣為原材料，利用纖維素酶對(duì)原料進(jìn)行酶解，可以獲得其水溶性膳食纖維等提取液，添加輔料可混合調(diào)配成一類酸甜適口，體系均一，滋味純正，并且具有一定保健功能的膳食纖維類飲料。且研究發(fā)現(xiàn)其具有較好的穩(wěn)定性[17]。

4.4在酒精發(fā)酵中的應(yīng)用

通過(guò)在原料中添加纖維素酶來(lái)釀酒，可以增加出酒量，節(jié)約糧食20%左右，而且釀出的酒酒味醇香，雜醇油含量低。尤其是白酒當(dāng)中，添加纖維素酶以后，可以同時(shí)將淀粉和纖維素轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵性的糖，再經(jīng)過(guò)酵母分解而全部轉(zhuǎn)化為酒精，提高出酒率且酒的品質(zhì)純正。在實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)用纖維素酶，不僅可以提高發(fā)酵產(chǎn)率，而且能夠顯著縮短發(fā)酵時(shí)間[1]。此外，利用纖維素酶水解木質(zhì)素生產(chǎn)乙醇用于化工、能源等方面對(duì)于目前的全球資源短缺現(xiàn)狀的緩解也具有重要意義。

5纖維素酶在纖維廢渣回收利用方面的應(yīng)用

利用其纖維素酶或微生物,把農(nóng)副產(chǎn)品、城市廢料中的纖維素進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成為酒精、葡萄糖和單細(xì)胞蛋白質(zhì)等產(chǎn)品,這對(duì)于開辟食品工業(yè)的原材料來(lái)源、提供新型能源和變廢為寶等方面具有十分重要的價(jià)值和意義。例如纖維素酶應(yīng)用于動(dòng)物飼料的添加劑、紡織、造紙、醫(yī)藥保健、石油開采、新型能源、環(huán)保等領(lǐng)域都具有很大的潛力。

6展望

篇4

關(guān)鍵詞：木聚糖酶（DSB）；甘露聚糖酶ManA；畢赤酵母（Pichia pastoris）；共表達(dá)

中圖分類號(hào)：Q19 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2017）10-1971-02

DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2017.10.043

Co-expression of Two Hemicellulases in Pichia pastoris

YANG Qing1，ZHANG Li1，ZHANG Hua-shan2，XIONG Hai-rong1

（1.College of Life Science，South-central University for Nationalities，Wuhan430074，China；2.Key Laboratory of Fermentation Engineering，Ministry of Education，Hubei University of Technology，Wuhan 430068，China）

Abstract：Based on the directional modification of xylanase（DSB） and mannan（ManA） synthase genes in our laboratory，the co-expression of these two hemicellulases was successfully achieved in a Pichia cell by different integration sites and resistance markers. And the recombinant strain GS115/DSB-ManA was obtained. The thermal stability test showed that the DSB and ManA produced by the co-expressed strain had high thermal stability. The successful expression of the two enzymes of the recombinant strain laid a foundation for the research and production of the complex enzyme preparation.

Key words：xylanase （DSB）； mannanase （ManA）； Pichia pastoris； co-expression

β-木聚糖酶（EC 3.2.1.8）和β-甘露聚糖酶（EC 3.2.1.78）均屬于半纖維素酶，分別水解半纖維素中的β-1，4-木糖苷鍵和β-1，4-甘露糖苷鍵。木聚糖為半纖維素中最豐富的一類[1]，在木聚糖酶的作用下可被降解為國(guó)際市場(chǎng)上急需的低聚木糖和木糖。甘露聚糖作為半纖維素第二大組分[2]，廣泛存在于木材以及植物的塊莖和種子中。

隨著對(duì)半纖維素酶的深入研究，其應(yīng)用領(lǐng)域也在不斷的擴(kuò)展，并擁有一個(gè)廣泛的工業(yè)酶應(yīng)用市場(chǎng)，包括食品和飼料、咖啡萃取、生物乙醇生產(chǎn)、殺黏菌劑、制藥、紡織、洗滌、造紙、石油、天然氣工業(yè)及生物技術(shù)等領(lǐng)域[3，4]。工業(yè)生產(chǎn)中，不僅需要高活力的酶，還需要酶在酸性環(huán)境、堿性環(huán)境或高溫條件下保持穩(wěn)定的酶學(xué)特性[5]，同時(shí)也希望減低生產(chǎn)成本而提高效益。本試驗(yàn)研究了木聚糖酶與甘露聚糖酶的共表達(dá)，實(shí)現(xiàn)了這兩種酶在畢赤酵母中的穩(wěn)定共表達(dá)，使工業(yè)生產(chǎn)中有效地減少生產(chǎn)成本及相關(guān)處理環(huán)節(jié)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌種與質(zhì)粒 大腸桿菌Top10細(xì)胞、表達(dá)載體pAO815hr為中南民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保藏與構(gòu)建。畢赤酵母GS115和表達(dá)載體pPICZαA為中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所惠贈(zèng)。

1.1.2 工具酶及試劑限制性內(nèi)切酶 T4 DNA連接酶等工具酶和DNA Marker購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；燕麥木聚糖和角豆膠購(gòu)自Sigma公司；Tryptone、Yeast Extract購(gòu)自于Oxoid公司；無(wú)氨基酵母氮源（YNB）、D-sorbitol、Agar購(gòu)自Biosharp公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基和抗生素 畢赤酵母抗性選擇平板YPDSZ（含終濃度100 μg/mL Zeocin），畢赤酵母組氨酸缺陷型選擇平板MD，畢赤酵母生長(zhǎng)/誘導(dǎo)培養(yǎng)基BMGY/BMMY，大腸桿菌生長(zhǎng)培養(yǎng)基LB/LBL，畢赤酵母生長(zhǎng)培養(yǎng)基YPD等培養(yǎng)基配方見Invitrogen公司畢赤酵母操作手冊(cè)。氨芐青霉素（Ampicillin Sodium Salt）購(gòu)自Biosharp公司；博來(lái)霉素（Zeocin）購(gòu)自Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 木聚糖酶DSB與甘露聚糖酶ManA重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及篩選 采用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和NotⅠ分別雙酶切木聚糖酶DSB基因和表達(dá)載體pAO815hr，連接后轉(zhuǎn)化，涂布于含有氨芐青霉素的LB固體平板上；同樣用EcoRⅠ和NotⅠ分別雙酶切甘露聚糖酶ManA基因和表達(dá)載體pPICZαA，連接后轉(zhuǎn)化，涂布于含有博來(lái)霉素的LB固體平板上。菌落PCR驗(yàn)證后雙酶切鑒定篩選出陽(yáng)性克隆菌株DSB-pAO815hr-Top10和ManA-pPICZαA-Top10。

1.2.2 木聚糖酶與甘露聚糖酶共表達(dá)重組菌的構(gòu)建及篩選

1）GS115/pAO815hr-DSB重組菌的構(gòu)建及篩選。采用SalⅠ線性化重組質(zhì)粒DSB-pAO815hr，電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞，挑取100個(gè)該共表達(dá)重組菌的單菌落使用BMGY/BMMY誘導(dǎo)產(chǎn)酶，使用DNS法[6]檢測(cè)酶活力，依據(jù)酶活力高低篩選出酶活力較高的重組菌株GS115/pAO815hr-DSB。

2）共表達(dá)重組菌GS115/DSB-ManA的構(gòu)建及篩選。采用SacⅠ線性化重組質(zhì)粒ManA-pPICZαA，電擊轉(zhuǎn)化GS115/pAO815hr-DSB感受態(tài)細(xì)胞[7]，按上述方法篩選出共表達(dá)重組菌株GS115/DSB-ManA。

1.2.3 GS115/DSB-ManA產(chǎn)甘露聚糖酶與木聚糖酶熱穩(wěn)定性的檢測(cè) 將發(fā)酵上清液在不同溫度下準(zhǔn)確處理30 min，迅速置于冰上冷卻，分別在DSB最適溫度（75 ℃）與 pH（6.5）下與木聚糖底物反應(yīng)和在ManA最適溫度（75 ℃）與 pH（6.0）下與角豆膠底物反應(yīng)，使用分光光度計(jì)檢測(cè)OD540 nm，以每種酶最高酶活力為100%，計(jì)算各酶在其他溫度處理后的相對(duì)殘余酶活力，每組試驗(yàn)均重復(fù)3次，取平均值作為最終結(jié)果。

1.2.4 SDS-PAGE電泳 發(fā)酵結(jié)束后，取GS115/DSB-ManA與兩種酶單一表達(dá)菌株的上清液進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，具體操作方法參考《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第二版。

2 結(jié)果與分析

2.1 木聚糖酶（DSB）與甘露聚糖酶（ManA）重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

將DSB基因片段連接到pAO815hr上，獲得表達(dá)質(zhì)粒pAO815hr-DSB；將ManA基因片段連接到pPICZαA上，獲得表達(dá)質(zhì)粒pPICZαA-ManA，物理圖譜如圖1所示，雙酶切驗(yàn)證以上重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.2 熱穩(wěn)定性分析

如圖2所示，GS115/DSB-ManA中木聚糖酶在45～70 ℃下處理30 min能夠保持85%以上相對(duì)酶活力，但經(jīng)過(guò)70 ℃以上溫度處理后，相對(duì)酶活力降低較為明顯；甘露聚糖酶在45～75 ℃下處理30 min后仍能保持90%以上相對(duì)酶活力，但經(jīng)過(guò)75 ℃以上溫度處理后，相對(duì)酶活力降低較為顯著。

2.3 SDS-PAGE分析

結(jié)果（圖3）表明，GS115/DSB-ManA發(fā)酵上清液中出現(xiàn)兩條電泳條帶，分別與單一表達(dá)DSB和ManA發(fā)酵上清液對(duì)比。GS115/DSB-ManA能夠同時(shí)表達(dá)出兩種半纖維素酶蛋白，且產(chǎn)物雜、蛋白的分泌量偏低。GS115/DSB-ManA分泌木聚糖酶蛋白較分泌甘露聚糖酶蛋白量高。

3 討論

目前木聚糖酶與甘露聚糖酶已成功應(yīng)用于工業(yè)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的諸多領(lǐng)域，且通常是木聚糖酶和甘露聚糖酶聯(lián)合使用從而達(dá)到協(xié)同增效。pPIC9K和 pPICZαA質(zhì)粒同屬于畢赤酵母分泌型表達(dá)質(zhì)粒，本試驗(yàn)通過(guò)不同的整合位點(diǎn)和抗性標(biāo)記實(shí)現(xiàn)了DSB和ManA在同一宿主中的整合與篩選，成功構(gòu)建了共表達(dá)菌株GS115/DSB-ManA，實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)酶的共同生產(chǎn)，同時(shí)檢測(cè)出其分泌的兩種半纖維素酶有較高的熱穩(wěn)定性，為進(jìn)一步工業(yè)化生產(chǎn)復(fù)合酶奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

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篇5

關(guān)鍵詞：阿拉伯/木糖苷酶；木聚糖酶；pET-20b（+）；多功能半纖維素酶；克??；表達(dá)

中圖分類號(hào)：Q785 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2014）17-4205-03

Cloning and Expression of a Trifunctional Hemicellulase Using pET-20b in Escherichia coli

PENG Jing-jing

（College of Biology and Enology， Taishan University， Taian 271021， Shandong， China）

Abstract： The structure gene from Thermoanaerobacter ethanolicus JW200 encoding arabinosidase-xylosidase XarB gene was amplified and ligated into pET-20b（+）， resulting in pET-20b-xarB. The structure gene from Thermomyces lanuginosus DSM 5826 encoding xylanase（XynA） was amplified and ligated into pET-20b-xarB， resulting in pET-20b-xarB-xynA. The trifunctional enzyme （XarB-XynA） was obtained after expression pET-20b-xarB-xynA in Escherichia coli JM109（DE3）. SDS-PAGE analysis showed that the molecular mass of the expressed recombinant XarB-XynA was about 108 kDa， the same as the predicted size.

Key words： arabinosidase-xylosidase； xylanase； pET-20b（+）；XarB-XynA； cloning； expression

農(nóng)業(yè)廢棄物是指農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和農(nóng)副產(chǎn)品加工后的剩余物，主要包括農(nóng)作物或果樹的秸稈或枝條、果實(shí)外殼、玉米芯、甘蔗渣等，其主要化學(xué)成分是纖維素、半纖維素、木質(zhì)素等，是亟待開發(fā)的重要可再生資源。我國(guó)每年秸稈產(chǎn)量達(dá)6億t左右，目前大部分秸稈用于燃燒或者被廢棄[1]。秸稈中半纖維素的含量占總干重的25%～50%，其化學(xué)結(jié)構(gòu)較纖維素復(fù)雜，其徹底降解的產(chǎn)物主要是木糖和少量阿拉伯糖、葡萄糖醛酸，可以用作基本碳源生產(chǎn)有機(jī)酸、氨基酸、單細(xì)胞蛋白、糖醇、工業(yè)酶類溶劑或燃劑。

來(lái)自嗜熱厭氧乙醇菌（Thermoanaerobacter ethanolicus，JW200）的阿拉伯/木糖苷酶，以人工底物進(jìn)行測(cè)試，其木糖苷酶活性和阿拉伯糖苷酶活性分別為每毫克蛋白質(zhì)180和1 000 U，高于其他木糖苷酶或阿拉伯糖苷酶的活性[2]。疏棉狀嗜熱絲孢菌（T. lanuginosus DSM 5826）所產(chǎn)生的木聚糖酶A（XynA）屬于G/11家族，具有較好的熱穩(wěn)定性，在高溫和堿性條件下有效且穩(wěn)定，沒(méi)有纖維素活性，具有工業(yè)化應(yīng)用前景，且研究發(fā)現(xiàn)，該木聚糖酶優(yōu)先降解高聚合度的木聚糖鏈，產(chǎn)物是不同聚合度的低聚木糖，不產(chǎn)生木單糖，這對(duì)于生產(chǎn)低聚木糖具有很好的應(yīng)用價(jià)值[3]。同時(shí)使用多種克隆的特異水解某一多糖結(jié)構(gòu)的水解酶來(lái)降解木聚糖，清潔高效，但工序復(fù)雜，成本高。在不改變酶自身優(yōu)良性質(zhì)的條件下，如果將有關(guān)的水解酶融合串聯(lián)成一個(gè)具有多種水解酶活性的多功能酶，或通過(guò)融合標(biāo)簽回收重復(fù)利用酶，來(lái)提高融合酶的綜合效率，這將大大簡(jiǎn)化工序并降低成本[4-6]。

本研究采用帶有T7強(qiáng)啟動(dòng)子的pET系列表達(dá)載體，將嗜熱厭氧乙醇菌的雙活性阿拉伯/木糖苷酶（XarB）和來(lái)源于疏棉狀嗜熱絲孢菌木聚糖酶A（XynA）進(jìn)行基因融合，得到多功能酶的融合表達(dá)質(zhì)粒pET-20b-xarB-xynA。通過(guò)蛋白質(zhì)工程構(gòu)建多功能半纖維素酶（XarB-XynA）來(lái)促進(jìn)生物轉(zhuǎn)化，為酶法降解半纖維素的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株：E. coli DH10B、E. coli JM109（DE3）（購(gòu)自Promega公司）。

Luria-Bertani（LB）培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，酵母膏5 g/L，NaCl 10 g/L。固體培養(yǎng)基添加終濃度為2%的瓊脂粉。

含有雙活性阿拉伯/木糖苷酶（XarB）的重組質(zhì)粒pHsh-xarB、含有疏棉狀嗜熱絲孢菌 （T. lanuginosus DSM 5826）木聚糖酶A（XynA）基因的質(zhì)粒pHsh-xynA2由本實(shí)驗(yàn)早期構(gòu)建并保存。質(zhì)粒pET-20b（+） （購(gòu)自Novagen 公司）。

1.2 方法

1.2.1 基因組提取 DNA 操作采用分子克隆技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行。質(zhì)粒轉(zhuǎn)化采用電轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行，質(zhì)粒和PCR產(chǎn)物采用Qiagen plasmid kit 和PCR purification kit（Qiagen USA）進(jìn)行純化。

1.2.2 基因克隆 根據(jù)GenBank中嗜熱厭氧乙醇菌（JW200）雙活性阿拉伯/木糖苷酶（XarB）的基因序列（GenBank登錄號(hào)AF135015）設(shè)計(jì)引物xarB-N和xarB-C。xarB-N ： 5’- CCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGAAGCCATTATATTTAGAT-3’，下劃線為 XbaⅠ酶切位點(diǎn)。xarB-C：5’- CCCGATATC TTTATTCTCTACCCTTACTTCC -3’，下劃線為 EcoR V酶切位點(diǎn)。以提取的重組質(zhì)粒pHsh-xarB為模板， 利用相應(yīng)的上下游引物擴(kuò)增雙活性阿拉伯/木糖苷酶基因xarB，為提高所擴(kuò)增片段的保真性，用Pyrobest DNA 酶對(duì)模板進(jìn)行擴(kuò)增。具體方法見參考文獻(xiàn)[2，3]。所得質(zhì)粒命名為pET-20b-xarB，雙酶切驗(yàn)證正確的質(zhì)粒送上海美吉生物技術(shù)公司測(cè)序。

根據(jù)GenBank中疏棉狀嗜熱絲孢菌（DSM 5826）木聚糖酶A（XynA）基因序列（GenBank 登錄號(hào)U35436）以及本試驗(yàn)優(yōu)化的pHsh-XynA2的木聚糖酶A（XynA）基因序列，以重組質(zhì)粒pHsh-xynA2為模板，設(shè)計(jì)引物xynA-N和xynA-C。xynA-N： 5’-CCCGATATCATGCAGACTACCCCGA-3’，下劃線為EcoR V酶切位點(diǎn)。xynA-C：5’-CCGCTCGAGGCCAACGTCAGCAACA-3’，下劃線為為 XhoⅠ酶切位點(diǎn)。

以pHsh-xynA2為模板，利用相應(yīng)的上下游引物擴(kuò)增基因xynA，為提高所擴(kuò)增片段的保真性，用Pyrobest DNA 酶對(duì)模板進(jìn)行擴(kuò)增。具體方法見參考文獻(xiàn)[2，3]。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè)正確后純化，將pET-20b-xarB質(zhì)粒和PCR擴(kuò)增純化后的DN段分別用EcoR V和XhoⅠ雙酶切，割膠回收DN段和載體酶切產(chǎn)物，乙醇沉淀濃縮，16 ℃下連接6～12 h。連接液轉(zhuǎn)化至E.coli DH10B，挑取陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒用EcoR V和XhoⅠ內(nèi)切酶酶切驗(yàn)證，得到重組質(zhì)粒pET-20b-xarB-xynA，雙酶切驗(yàn)證正確的質(zhì)粒送上海美吉生物技術(shù)公司測(cè)序。

1.2.3 重組蛋白的表達(dá)與純化 重組質(zhì)粒pET-20b-xarB-xynA電轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞E. coli JM109 （DE3）中，挑取重組單菌落接種于含100 μg/mL的氨芐青霉素的 LB 培養(yǎng)液中培養(yǎng)，至OD600 nm為0.6～0.8，加IPTG至濃度為0.8 mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)6 h后，離心收集菌體。用50 mmol/L pH為7.5的 Tris-HCl 緩沖液洗滌細(xì)胞2次，并用相同緩沖液重懸細(xì)胞，置于冰水浴中用超聲波破碎儀破碎細(xì)胞， 超聲條件為50 Hz×15 s×8， 細(xì)胞碎片于12 000 r/min 離心10 min，去除上清液即為粗酶液。將粗酶液在60 ℃熱處理30 min后，4 ℃ 12 000 r/min 離心30 min去除變性蛋白。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒pET-20b-xarB的構(gòu)建

根據(jù)GenBank中嗜熱厭氧乙醇菌（JW200）雙活性阿拉伯/木糖苷酶基因xarB的序列，以重組質(zhì)粒pHsh-xarB為模板，用引物xarB-N和xarB-C進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖1A所示，擴(kuò)增出來(lái)的片段與基因?qū)嶋H大小2 355 bp是相符的。

PCR產(chǎn)物驗(yàn)證正確后過(guò)柱純化，并用XbaⅠ和EcoR V進(jìn)行雙酶切，酶切后的pET-20b（+）質(zhì)粒進(jìn)行連接，得到重組質(zhì)粒pET-20b-xarB。重組質(zhì)粒經(jīng)EcoR V單酶切后釋放出6 000 bp大小的條帶，經(jīng)XbaⅠ和EcoR V雙酶切后，釋放出2 300 bp大小的條帶，與基因大小一致，同時(shí)在3 700 bp處有一條帶和pET-20b（+）載體酶切后條帶大小一致，結(jié)果如圖1B所示，測(cè)序結(jié)果表明基因xarB序列與公布的序列完全一致。

2.2 重組質(zhì)粒pET-20b-xarB-xynA的構(gòu)建

以重組質(zhì)粒pHsh-xynA2為模板，以xynA-N和xynA-C為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將純化后的DN段與pET-20b-xarB分別用EcoR V和XhoⅠ進(jìn)行

雙酶切，連接后挑選陽(yáng)性克隆，得到重組質(zhì)粒pET-20b-xarB-xynA。重組質(zhì)粒經(jīng)XhoⅠ單酶切后釋放出6 600 bp大小的條帶，經(jīng)XbaⅠ和XhoⅠ雙酶切后，釋放出2 955 bp大小的條帶，與基因（xarB+xynA）大小一致，同時(shí)在3 700 bp處有一條帶和pET-20b（+）載體酶切后條帶大小一致，酶切結(jié)果如圖2所示。

2.3 重組多功能半纖維素酶的表達(dá)及檢測(cè)

將重組質(zhì)粒pET-20b-xarB-xynA電轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞E. coli JM109（DE3）中，挑取重組單菌落接種于含100 g/mL 的氨芐青霉素的 LB 培養(yǎng)液中培養(yǎng)至OD600 nm為0.6～0.8，加IPTG至濃度為0.8 mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)6 h 后，離心收集菌體。以pET-20b（+）轉(zhuǎn)化產(chǎn)物為對(duì)照，SDS-PAGE分析結(jié)果表明，重組菌均能產(chǎn)生約108 kDa的特異條帶，結(jié)果如圖3所示，與預(yù)期的蛋白質(zhì)相對(duì)分子量大小一致。

3 討論

雖然已有多種木聚糖酶被提純或基因克隆，并且這些酶在底物特異性熱穩(wěn)定性及酶反應(yīng)的底物范圍等性能方面都各有優(yōu)勢(shì)，但是相對(duì)于半纖維素結(jié)構(gòu)及其降解的復(fù)雜特點(diǎn)，僅靠自然菌種所產(chǎn)酶的單一優(yōu)良性質(zhì)仍不能實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)廢棄物的高效利用，也不能滿足工業(yè)生產(chǎn)的需要。重組酶XarB這個(gè)雙重活性的酶可與木聚糖酶協(xié)同作用徹底降解阿拉伯木聚糖，是工業(yè)酶制劑的理想酶源，從而為構(gòu)建多功能半纖維素融合酶提供一個(gè)很好的酶材料。

本研究將來(lái)源于嗜熱厭氧乙醇菌雙活性阿拉伯/木糖苷酶（XarB）和來(lái)源于疏棉狀嗜熱絲孢菌木聚糖酶A（XynA）同時(shí)構(gòu)建到pET-20b（+）上，得到融合酶表達(dá)質(zhì)粒pET-20b-xarB-xynA，并且在大腸桿菌里面成功表達(dá)。雙活性阿拉伯/木糖苷酶（XarB）和木聚糖酶（XynA）融合后所得的雜合酶在降解農(nóng)業(yè)廢棄物方面有著明顯的優(yōu)勢(shì)，將有助于提高農(nóng)業(yè)廢棄物的降解效率。

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篇6

關(guān)鍵詞： 褐色高溫單孢菌 纖維素酶 固定化

一、前言

在化工資源貯藏量不斷減少的今天，通過(guò)可再生纖維素資源的生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)葡萄糖和乙醇已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)[1]-[2]。纖維素酶是降解纖維素生成葡萄糖的一組酶的總稱，其最大的潛在用途是把纖維素類物質(zhì)酶法水解成葡萄糖。迄今為止，已有很多關(guān)于纖維素酶生產(chǎn)菌株的研究報(bào)道[3]-[4]，但其中多數(shù)以真菌如黑曲霉（Aspergillusniger）和木霉（Trichodermareesei）等為研究對(duì)象。由細(xì)菌、放線菌所產(chǎn)生的中性纖維素酶和堿性纖維素酶，在洗滌劑工業(yè)中的應(yīng)用已引起人們的高度重視[5]-[6]。有關(guān)褐色高溫單孢菌PE-211（Thermomonospora fusca PE-211）產(chǎn)纖維素酶的性質(zhì)，黎海彬等[7]-[8]已做了研究，但對(duì)該酶的固定化未見有報(bào)道。本研究對(duì)發(fā)酵的粗酶液進(jìn)行了純化，再制備成固定化酶，然后對(duì)其最適反應(yīng)溫度、pH值、耐熱性及米氏常數(shù)等進(jìn)行了研究，望能為其在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、輕工業(yè)等方面的應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

二、材料和方法

1.實(shí)驗(yàn)材料

（1）菌種

褐色高溫單孢菌PE-211（Thermomonospora fusca PE-211）[7]。

（2）試劑

分離介質(zhì)SephadexG-100（德國(guó)Phamacia）；羧甲基纖維素鈉（美國(guó)Sigma）；牛血清白蛋白為進(jìn)口分裝；其余均為國(guó)產(chǎn)分析純或化學(xué)純。

（3）儀器

高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)貝克曼公司）；紫外可見分光光度計(jì)（上海第三分析儀器廠）；核酸蛋白檢測(cè)儀、梯度儀、恒流泵、自動(dòng)部分收集儀（上海滬西分析儀器廠）等。

（4）搖瓶產(chǎn)酶培養(yǎng)基

在Hagerdal Medium[3]中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%的微晶纖維素作為碳源。

2.實(shí)驗(yàn)方法

（1）蛋白質(zhì)含量測(cè)定

采用Folin-酚法測(cè)定蛋白質(zhì)含量[9]，以牛血清白蛋白（BSA）做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（2）SDS-PAGE[10]

采用垂直板式不連續(xù)系統(tǒng)電泳，分離膠濃度10%，濃縮膠濃度4%，用0.25%（W/V）考馬斯亮藍(lán)G-250染色。

（3）殼聚糖的制備[11]-[12]

將蝦皮洗凈，然后去掉殘余的蝦肉，用3～4倍量體積的4%的稀鹽酸和10%的NaOH反復(fù)處理4～5次，每次8～10h，用水洗至中性。所得的白色幾丁質(zhì)加入50%的NaOH，于80℃～100℃下保溫處理6～7h后，再水洗至中性，曬干粉碎，過(guò)40目篩即得。

（4）粗酶的制備[8]

在裝有100ml產(chǎn)酶培養(yǎng)基的500mL三角瓶中接入10ml種子液，于55℃、200r/min下培養(yǎng)24～48h，取培養(yǎng)液以4000r/min的速度離心20min，所得上清液即為粗酶液。

（5）粗酶液的純化

①硫酸銨沉淀和透析。取粗酶液，加入硫酸銨至30%飽和度，在4℃，10000r/min下離心10min，收集沉淀物，再溶于少量磷酸緩沖液中，透析除鹽，制得經(jīng)硫酸銨沉淀的純化酶液。

②葡聚糖凝膠層析。葡聚糖凝膠SephadexG-100經(jīng)充分溶脹后上柱，柱子經(jīng)0.10mol/L的pH6.0的磷酸緩沖液充分平衡后上樣，每6min收集一管，分別測(cè)定各管的纖維素酶活。

（6）纖維素酶的固定化[13]-[14]

取一定量的殼聚糖于6%的戊二醛中攪拌2.5h，4℃過(guò)夜，然后洗去殘余的戊二醛，在交聯(lián)后的殼聚糖中加入纖維素酶液，室溫下攪拌2.0h，于4℃靜置過(guò)夜，再洗去游離酶，即得固定化酶。

（7）纖維素酶（CMCase）活力的測(cè)定及定義[15]

酶活力的測(cè)定以羧甲基纖維素鈉鹽（CMC-Na）作底物，經(jīng)纖維素酶水解后生成還原糖，然后用DNS（二硝基水楊酸）法測(cè)定還原糖的含量，由還原糖的量來(lái)求得酶活力的大小。

取0.5ml適當(dāng)稀釋的酶液，與1.5ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.7%的CMC-Na溶液混合，在65℃下反應(yīng)30min，取出加入3mlDNS顯色液，然后煮沸5min，停止反應(yīng)，冷卻，于分光光度計(jì)上530nm處比色（空白試驗(yàn)中除酶液事先滅活外，其余條件不變）。

一個(gè)酶活單位被定義為在1min內(nèi)轉(zhuǎn)化底物產(chǎn)生1μmol還原糖（按葡萄糖計(jì)）所需的酶量。

（8）固定化酶的動(dòng)力學(xué)

分別在不同的pH及溫度下，測(cè)定其對(duì)酶反應(yīng)速度的影響，并在不同的底物濃度下測(cè)定固定化酶的米氏常數(shù)K和V。

三、結(jié)果

1.硫酸銨沉淀

發(fā)酵粗酶液經(jīng)離心去除菌體和殘?jiān)?，在其上清液中緩慢加入硫酸銨至30%的飽和度，4℃過(guò)夜，離心、去除雜蛋白。于上清液中緩慢補(bǔ)加入硫酸銨至80%飽和度，4℃過(guò)夜，離心收集沉淀，沉淀物溶于檸檬酸緩沖液中。透析檢查無(wú)銨離子后，計(jì)算其收率為65.73%。

2.第一次SephadexG-100柱層析

經(jīng)硫酸銨鹽析后的透析液加到平衡好的SephadexG-100柱上，再用同樣的緩沖液洗脫，洗脫曲線為三個(gè)峰（峰Ⅰ、峰Ⅱ、峰Ⅲ），經(jīng)檢測(cè)主要的纖維素酶活力包括在峰Ⅲ中，但SDS-PAGE結(jié)果表明還有雜蛋白存在，其純化倍數(shù)為30.87，結(jié)果見表1。

3.第二次SephadexG-100柱層析

將第一次洗脫峰Ⅲ合并，進(jìn)行第二輪SephadexG-100柱層析，纖維素酶活都包括在峰Ⅲ中，SDS-PAGE結(jié)果表明酶的純度很高。將具有纖維素酶活的峰Ⅲ合并，測(cè)定每一步純化操作中的蛋白濃度和酶活力，計(jì)算比活力，結(jié)果見表1。結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)SephadexG-100柱純化后，酶的比活力為54.15IU/mg，提純倍數(shù)為47.50。

4.不同酶量對(duì)固定化酶活力的影響

取7份1.5g殼聚糖與戊二醛的交聯(lián)物，分別加入2ml、3ml、4ml、5ml、6ml、7ml、8ml的酶液，固定化后測(cè)定其酶活力，結(jié)果見圖1。

5.固定化纖維素酶的最適pH

取一定量的固定化酶，分別在pH為5、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0下測(cè)定其酶活力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)固定化酶在pH為8.5時(shí)，酶的活力最高，如圖2所示。

6.固定化纖維素酶的最適溫度

取一定量的固定化酶，分別在35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃下測(cè)定其酶活，結(jié)果發(fā)現(xiàn)固定化酶在溫度為70℃時(shí)，酶的活力最高。

7.固定化纖維素酶的耐熱性實(shí)驗(yàn)

取10份固定化酶和原酶，分別置于70℃的水浴中，每間隔10min取出一管，按上述方法測(cè)定其酶活力，連續(xù)進(jìn)行100min，結(jié)果如圖4所示。

8.固定化酶的米氏常數(shù)

用等量的固定化酶與不同的底物濃度于65℃下反應(yīng)15min，測(cè)定其吸收值，用雙倒數(shù)作圖法作圖，測(cè)定酶的米氏常數(shù)和最大反應(yīng)速度，結(jié)果見表2。由雙倒數(shù)作圖可知，以CMC-Na為底物，固定化纖維素酶的Km為7.19mg/ml，Vmax為0.132mg/ml·min，而原酶液的Km為7.27mg/ml。

四、討論

圖1結(jié)果表明，隨著加入酶量的增加，其酶活力隨著增大，但當(dāng)加入的酶量增加到一定程度時(shí)，酶活力增加變得緩慢，這可能是由于在酶的固定化過(guò)程中，一定量交聯(lián)后的載體，其活性基團(tuán)是一定的，結(jié)合位點(diǎn)未被飽和之前，固定化酶的活力會(huì)隨加入酶量的增加而增大，一旦結(jié)合位點(diǎn)被飽和后，再增加加入的酶量卻不能增加酶活力。

如圖2所示，原酶的最適pH值為9.0，可能由于殼聚糖是陽(yáng)離子型載體，因而固定化酶的最適pH值比原酶要低。

如圖3所示，而且固定化酶的熱穩(wěn)定性較原酶高，在60℃～80℃時(shí)酶活力都較高。這表明纖維素酶經(jīng)固定化后，對(duì)熱的穩(wěn)定性明顯提高。

圖4的結(jié)果表明，褐色高溫單孢菌纖維素酶的耐熱性很強(qiáng)，保溫100min后，固定化酶的酶活基本保持不變，而且固定化酶比原酶具有較高的熱穩(wěn)定性，由此可以看出，固定化酶的適應(yīng)性更強(qiáng)，可廣泛應(yīng)用于工業(yè)、農(nóng)業(yè)、輕工業(yè)等各個(gè)方面。

表2結(jié)果表明該纖維素酶在固定化后，其米氏常數(shù)略有減小，說(shuō)明纖維素酶經(jīng)固定化后，與底物的親和力有所增加。

五、結(jié)語(yǔ)

褐色高溫單孢菌PE-211纖維素酶經(jīng)硫酸銨鹽析和SephadexG-100柱純化后，粗酶液被純化47.5倍，比活力為54.15IU/mg。酶動(dòng)力學(xué)研究表明，固定化酶的最適pH為8.5，最適溫度為70℃，且固定化酶在60℃～80℃活力較高；該酶的耐熱性強(qiáng)，而固定化酶的熱穩(wěn)定性比原酶強(qiáng)；以羧甲基纖維素鈉為底物，固定化酶的K為7.19mg/ml，V為0.132mg/ml·min。

有關(guān)褐色高溫單孢菌PE-211固定化纖維素酶在解決能源危機(jī)及可再生資源利用等方面有待進(jìn)一步研究。

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[14]朱啟忠，殼聚糖固定化半纖維素酶的研究[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2000.

篇7

先鋒霉素是頭孢類抗菌素，于70年代進(jìn)入醫(yī)院。它的抗菌范圍很廣，最初用于治療金黃色葡萄球菌感染，良好的療效使之初露鋒芒。到了80年代，可以口服的先鋒4號(hào)(頭孢氨芐)和先鋒6號(hào)(頭孢拉定)先后用于臨床。于是它被廣泛使用，處處充當(dāng)抗菌的“先鋒”，簡(jiǎn)直大紅大紫起來(lái)。

實(shí)際上，先鋒霉素是個(gè)“大家族”。這個(gè)家族共有三代成員：第一代：頭孢噻吩(先鋒1號(hào))、頭抱噻啶(2號(hào))、頭抱氨芐(4號(hào))、頭抱唑啉(5號(hào))、頭抱拉定(6號(hào))、頭孢硫咪(8號(hào))；第二代：頭孢孟多、頭抱呋新；第三代：頭抱噻肟、頭孢哌酮(先鋒必)、頭孢三嗪、頭抱他啶。

臨床上應(yīng)用的品種比以上介紹的還要多，但主要作用同第一代品種大同小異。第一代頭抱菌素主要適用于革蘭氏陽(yáng)性菌。特別是耐藥的金黃色葡萄球菌；第二代頭孢菌素的抗菌范圍較第一代，對(duì)革蘭氏陰性桿菌的效果比第一代好，而對(duì)陽(yáng)性菌的效果不如第一代；第三代頭抱菌素的抗菌范圍更廣，對(duì)陰性桿菌的作用更強(qiáng)。尤其是可作為綠膿桿菌的克星來(lái)使用，但對(duì)球菌的作用不如第一代、第二代。弄清了頭抱菌素每一代成員和它們不同的作用。在使用時(shí)才可以“量材錄用”而不致濫用。

篇8

中圖分類號(hào):R965.3

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

【摘要】 目的：研究紫草素的提取工藝。方法 用纖維素酶酶解紫草，丙酮液浸提，紫外分光光度法測(cè)定其吸收度。采用L9（34）正交設(shè)計(jì)法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。結(jié)果 最佳提取工藝: 在pH值5， 1‰的纖維素酶條件下，在35℃酶解紫草12h ，用丙酮液提取3次。結(jié)論 工藝合理、可行，質(zhì)量可控。

關(guān)鍵詞：紫草素 紫草 酶解法 正交試驗(yàn)

Study on Extracting Technigue of Shikonin from Arnebia Euchroma Johnst Optimized by orthogonal design

ABSTRACT:Aim To study a optimum preperation method of Shikonin by extraction from Arnebia Euchroma Johnst.Method Skikonin was extracted by acetone from enzyme decomposed mixture ，determination the absorption in UV .The test are arranged by orthogonal desige with L9（34）. Result The best prepering process is: pH 5，and consistency of the enzymeis 1‰，the enzyme decomposed temperature is 35℃,reaction times 12h, by acetone extraction 3 times .Conclusion The experiment results showed that the preperation method is possible and the quality of the product can be controled.

[Key words]: Arnebia Euchroma Johnst; Skikonin; enzyme ; orthogonal desige

紫草為紫草科植物新疆紫草Arnebia euchroma(Royle) Johnst, 紫草Lithos permumerythrorbizon Sieb et Zucc, 或內(nèi)蒙紫草Amebia guttata Bunge的干燥根[1],具有涼血、活血、解毒、透疹之功能。而從紫草的根中所提取的紫草色素（萘醌系色素），是一種天然食用色素，還可用于印染、制藥、化妝品等工業(yè)，近期研究發(fā)現(xiàn)其有顯著的抗癌作用[2]，有著廣闊的研究和開發(fā)前景。

大部分中藥材的細(xì)胞壁是由纖維素構(gòu)成，植物的有效成分往往包裹在細(xì)胞壁內(nèi)[3]。纖維素則是?-D-葡萄糖鍵以1，4-?-葡萄糖苷鍵連接，用纖維素酶酶解可破壞-D-葡萄糖苷鍵，從而破壞其細(xì)胞壁，進(jìn)而有利于有效成分的提取[4，5]。根據(jù)這一原理，選用纖維素酶酶解紫草，并用丙酮提取紫草色素，紫外分光光度法測(cè)定其吸收度，采用正交試驗(yàn)，選擇酶解溫度、酶解時(shí)間、酶解時(shí)所需pH值、酶的濃度四個(gè)因素，每個(gè)因素三個(gè)水平，用L9（34）正交表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（表1），得出最佳酶解條件。這對(duì)提高中藥材的利用率，減少浪費(fèi)，減少藥渣的處理和降低生產(chǎn)成本都具有較大的現(xiàn)實(shí)意義。

1、實(shí)驗(yàn)材料及儀器

1.1 材料：纖維素酶Cellulase(FEINBIOCHEMICA GMBH&CO.廣東省藥品檢驗(yàn)所提供)

紫草干燥的紫色根狀物（深圳市醫(yī)藥公司提供）

丙酮（化學(xué)試劑CP.級(jí)）

1.2 儀器：電子天平AE240 （METTLER）

電熱恒溫水浴鍋 HH.S11-2 （北京長(zhǎng)安科學(xué)儀器廠）

紫外分光光度計(jì)UV-2201 SPECTRO PHOTOMETER （日本島津）

2、實(shí)驗(yàn)方法

2.1 預(yù)試驗(yàn)

取碎紫草1g，加丙酮10ml在室溫（28℃，以下相同）下浸提取24h，濾過(guò)，殘?jiān)^續(xù)用等量丙酮浸提直至濾液無(wú)色，水浴蒸干紫草加入1‰的纖維素酶及10ml蒸餾水，測(cè)得pH7，在45℃條件下水浴酶解24h，濾過(guò)，所得紫草殘?jiān)≌舾?，用丙?0ml浸提24h，濾過(guò)，濾液呈淺紫色。

此試驗(yàn)表明，紫草經(jīng)酶解后提取可提高其提取率，即纖維素酶酶解紫草提高其有效成分的提取率試驗(yàn)具有可行性。

2.2 酶解

取碎紫草500g，分成10份，每份50g編號(hào)1～9，置于1000ml燒杯中，按正交表（表2）各加入適量的纖維素酶和蒸餾水550ml，用HCL溶液或NaOH溶液調(diào)節(jié)適當(dāng)?shù)膒H值，于不同溫度下酶解適當(dāng)時(shí)間后濾過(guò)，紫草殘?jiān)苷舾?，同時(shí)做一陰性對(duì)照試驗(yàn)（實(shí)驗(yàn)號(hào)為0）。

2.3 提取

將各試驗(yàn)號(hào)干紫草分別轉(zhuǎn)移至2000ml的錐形瓶中，各加入丙酮1000ml，密封搖勻，在室溫常壓下浸提24h，濾過(guò)，濾液取樣待測(cè)。

2.4 檢測(cè)

2.4.1 量取4號(hào)樣品0.2ml，用丙酮稀釋50倍，用UV-2201紫外分光光度計(jì)掃描，測(cè)得其吸收峰兩個(gè)，波長(zhǎng)分別為489.3nm和517.3nm，其中最大吸收波長(zhǎng)為517.3nm。

2.4.2 按編號(hào)各取樣0.2ml，用丙酮稀釋50倍，丙酮作空白，在室溫及λmax=517.3nm下測(cè)其吸收度A值。

3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 由A=E*C*L（A為吸收度，E為吸光系數(shù)，C為被測(cè)物濃度，L為吸收池厚度，E、L為定值，即A與C成正比，A值的大小可反映出濃度即提取率的大?。?，從表2與陰性試驗(yàn)對(duì)比可看出，經(jīng)纖維素酶酶解后紫草色素的提取率有明顯提高，即用酶解法酶解紫草提高紫草素的提取率的方案是可行的。

3.2 通過(guò)測(cè)定，可以初步確定酶解紫草的最佳酶解條件為A2B1C1D1，即T=35℃，t=12h，C=1‰為最佳酶解條件。

3.3 從各個(gè)水平的均數(shù)極差R看（R的大小反映對(duì)指標(biāo)影響的大?。蛩氐闹鞔雾樞?yàn)镈－A－C－B，即C因素為主要因素，其它因素則可根據(jù)對(duì)成本、時(shí)間、收益等的綜合考慮選取適當(dāng)?shù)乃?，?jīng)考慮，決定A2B1C1D1為最佳酶解方案。

3.4 紫草素的最佳提取工藝為在1‰的纖維素酶條件下，控制pH值為5，在35℃酶解紫草12h ，用丙酮液提取3次。經(jīng)試驗(yàn)，紫草素的提取率達(dá)0.9%以上。

4、討論

4.1 由于纖維素酶是一組多酶體的復(fù)合酶，可以切斷纖維素中的1.4－β-葡萄糖苷鍵，使大分子的纖維素降解成分子量較小的纖維二糖和葡萄糖分子，破壞植物細(xì)胞壁，使細(xì)胞內(nèi)含物質(zhì)得以充分釋放，因而可以提高紫草色素的提取率。

4.2 在提取過(guò)程中，酶解后的紫草均水浴蒸干后再提取，因紫草素具揮發(fā)性，在酶解過(guò)程中的紫草，紫草素?fù)]發(fā)損失可能多于陰性試驗(yàn)中的紫草，這可能造成實(shí)驗(yàn)誤差。

4.3 在紫草素的提取過(guò)程中，對(duì)于如何減少紫草素的耗損還有待于進(jìn)一步探討。

參考文獻(xiàn)

1 中華人民共和國(guó)藥典委員會(huì).中國(guó)藥典(2005年版)一部[S]：238.

2 章永紅編著.抗癌中藥大全［M］.江蘇科學(xué)技術(shù)出版社，2000：427-430.

3 馬田田.纖維素酶用于中藥提取的初步研究［J］.中草藥，1994，25（3）：123.

篇9

翻開一棟木質(zhì)的老式建筑的橫梁，幾只肥碩的白蟻正趴在上面大快朵頤。而不久，這棟年代感十足的建筑，也許就會(huì)傾塌在這些白蟻的利嘴之下。

但是，這種在2億年前的二疊紀(jì)就出現(xiàn)的生物，也許不久的將來(lái)，能為人類在新能源的探索上幫上大忙。廣東省昆蟲研究所的研究人員正在進(jìn)行一項(xiàng)“纖維素乙醇白蟻仿生技術(shù)研究”，試圖通過(guò)復(fù)制白蟻的特殊基因，將木質(zhì)纖維素轉(zhuǎn)化為酒精。而酒精（乙醇）是石油等不可再生資源的最佳替代物，有望在未來(lái)成為清潔能源的主力軍。

木質(zhì)纖維素可轉(zhuǎn)化為乙醇

廣東省昆蟲研究所研究員鐘俊鴻告訴記者，木質(zhì)纖維素是太陽(yáng)能極為重要的貯存形式。地球上每年光合作用可產(chǎn)生1000多億噸的植物干物質(zhì)，其中一半以上是纖維素和半纖維素。另外，人類活動(dòng)產(chǎn)生的廢棄物如農(nóng)業(yè)廢物，比如稻草、稻殼、麥稈、玉米芯、棉籽殼、甘蔗渣等；食品加工廢物，如果皮、果渣等；木材廢物，如木屑、樹皮等都含有大量的纖維素。

而我國(guó)每年產(chǎn)生木質(zhì)纖維素生物資源的總量約13.92億噸。其中，農(nóng)作物秸稈年產(chǎn)生量約7 億噸；森林采伐剩余物生物量1.09 億噸；木材加工產(chǎn)出剩余物約 0.418 億噸；木材制品拋棄物約 0.60 億噸；灌木林的生物量約為 1.81 億噸。但是每年如此多的木質(zhì)纖維素卻被白白地浪費(fèi)掉了。

目前，我國(guó)每年汽車年耗油約8000萬(wàn)噸，只需把每年產(chǎn)生的木質(zhì)纖維素的一半轉(zhuǎn)化為乙醇，其數(shù)量就可以超過(guò)我國(guó)汽油消費(fèi)總量的2倍以上。雖然現(xiàn)在利用人工的方法也能制造出酒精，但是由于木質(zhì)纖維素通常被難以降解的木質(zhì)素包裹，所以轉(zhuǎn)化效率很低。

白蟻可分解木質(zhì)纖維素

而這一難題在白蟻面前卻不值得一提，鐘俊鴻說(shuō)，就像人以五谷雜糧為食一樣，白蟻主要以木質(zhì)纖維素為食。

白蟻腸道的消化功能比大型食草動(dòng)物還要高效，它就像一座小型的生物反應(yīng)器――由研磨器（稱為咀嚼組織的下顎和前胃）、反應(yīng)池（消化道）、酶和微生物區(qū)系組成。在白蟻的長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中，它的消化系統(tǒng)已經(jīng)演變出一套能夠高效降解纖維素的腸道微生物群。在白蟻小小的腸道中，它自身產(chǎn)生的纖維素酶與來(lái)自微生物產(chǎn)生的纖維素酶高效配合，成為了消化木質(zhì)纖維素的利器。在一些熱帶干旱地區(qū)，白蟻能消耗掉超過(guò)90%的干木，它就像是森林的清道夫一樣，是熱帶地區(qū)木質(zhì)纖維素的重要降解者。

白蟻能夠高效地消化木質(zhì)纖維素，但是它并不能直接產(chǎn)生出酒精。鐘俊鴻說(shuō)，但是如果將白蟻降解木質(zhì)素的基因，以及白蟻腸道中微生物降解木質(zhì)素的基因提取出來(lái)，移植到工程菌（采用現(xiàn)代生物工程技術(shù)加工出來(lái)的新型微生物）上，那么，這些纖維素消化酶就能將木質(zhì)纖維素降解成單糖，再經(jīng)生物發(fā)酵就能產(chǎn)生乙醇。

找到能力超強(qiáng)白蟻

而目前的重點(diǎn)就是在種類繁多的白蟻中，找到擁有超強(qiáng)“消化”基因的種類，并將這些基因提取出來(lái)，通過(guò)生物技術(shù)增強(qiáng)效能后，再移植到工程菌的身上。鐘俊鴻說(shuō)，為了找到擁有超強(qiáng)消化基因的白蟻，研究室內(nèi)常年飼養(yǎng)著種類繁多的白蟻，還在室內(nèi)飼養(yǎng)了100多個(gè)白蟻巢，其中有3個(gè)巢的年齡已經(jīng)超過(guò)了19歲。此外，研究所還擁有多達(dá)3萬(wàn)件白蟻標(biāo)本。

通過(guò)對(duì)白蟻進(jìn)行基因測(cè)序，研究人員慢慢找到了白蟻纖維素酶基因性能超強(qiáng)的白蟻種類。研究小組發(fā)現(xiàn)，乳白蟻和散白蟻兩個(gè)屬種的白蟻，它們體內(nèi)白蟻纖維素酶的活性比其他白蟻種類都要出眾。

接下來(lái)，研究小組開始研究提高白蟻纖維素酶的活性的方法。因?yàn)榘紫侂m然具有超強(qiáng)的消化木質(zhì)纖維素的能力，但是在實(shí)際應(yīng)用時(shí)，酶的活性越高，產(chǎn)出的效率也越高。經(jīng)過(guò)反復(fù)的試驗(yàn)，研究人員找到了提高酶活的竅門――在適當(dāng)?shù)臏囟?、濕度以及食物的培育下，白蟻纖維素酶的活性會(huì)變得更高。而且通過(guò)放射線的照射，這些白蟻纖維素酶的活性還能進(jìn)一步提高。

篇10

1.“狼煙”的危害。①造成環(huán)境污染，危害人體健康。夏收、秋收時(shí)節(jié)，田間“狼煙四起”，城郊煙霧彌漫，對(duì)人類的呼吸道及心血管都會(huì)造成很大損害。②降低空氣的能見度，影響交通安全。秸稈燃燒起來(lái)會(huì)生成大量的白色固體煙霧，由于固體極小，所以呈粉末狀飄散，極大地降低了高速公路、機(jī)場(chǎng)等地方的能見度，影響交通安全。③引起火災(zāi)。農(nóng)田秸稈焚燒時(shí)一旦出現(xiàn)大火，火勢(shì)將很難控制，極容易造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。④導(dǎo)致耕地生產(chǎn)力下降。焚燒農(nóng)田秸稈會(huì)使土壤中的微生物死亡，有機(jī)質(zhì)變少、板結(jié)，給農(nóng)業(yè)的可持續(xù)性發(fā)展造成巨大的障礙。

2.“狼煙”屢禁不止的原因。我國(guó)《大氣污染防治法》早已禁止露天焚燒秸稈，但部分地區(qū)人們違法焚燒秸稈的情況仍然屢禁不止，我們通過(guò)在蘇北的農(nóng)村調(diào)研得知，人們之所以違法焚燒秸稈主要有以下幾個(gè)原因：①隨著農(nóng)村機(jī)械化程度的提高，牲畜的需要量大大減少，秸稈飼料的需求也大幅降低。②近年來(lái)農(nóng)村生活水平有所提高，許多農(nóng)民采用液化氣和電等清潔的生活能源，導(dǎo)致農(nóng)作物秸稈成為“徹底的廢棄物”。③秸稈分布零散、體積蓬松，收集運(yùn)輸成本高，產(chǎn)業(yè)化程度不高。④秸稈蠟質(zhì)層較厚，“秸稈還田”后若沒(méi)有降雨，入土后無(wú)法及時(shí)腐爛分解，給后續(xù)農(nóng)作物管理造成障礙。

3.廢變寶把醇產(chǎn)。以禁為主的措施不能從根本上解決“狼煙”問(wèn)題，“狼煙”既是環(huán)境污染問(wèn)題，也是資源浪費(fèi)的問(wèn)題。秸稈禁燒工作應(yīng)當(dāng)由“以禁為主”轉(zhuǎn)變?yōu)椤笆杞Y(jié)合”，為秸稈謀出路才是解決問(wèn)題的根本辦法。

秸稈的主要成分為難以降解的纖維素、半纖維素和木質(zhì)素。纖維素中的六碳糖和玉米淀粉中含有的葡萄糖一樣，可以用傳統(tǒng)的酵母發(fā)酵成乙醇。而半纖維素中含有的糖主要為五碳糖，傳統(tǒng)的酵母無(wú)法經(jīng)濟(jì)地將其轉(zhuǎn)化為乙醇。纖維素乙醇技術(shù)正是利用纖維素質(zhì)生物原料（如秸稈）生產(chǎn)乙醇燃料，這種燃料可以直接替代汽油等化石燃料，還能避免糧食作物生產(chǎn)的大量損耗，所以說(shuō)，隨著化石資源的逐漸枯竭和環(huán)境的日益惡化，大力推廣這種可再生能源技術(shù)已經(jīng)成為許多國(guó)家發(fā)展戰(zhàn)略的重要組成部分。

目前限制纖維素質(zhì)生物原料生產(chǎn)纖維素乙醇的主要障礙是纖維素酶發(fā)酵活力較低、成本較高。纖維素酶是一類能夠?qū)⒗w維素降解為葡萄糖的多組分酶的總稱，可催化秸稈發(fā)酵產(chǎn)生纖維素乙醇。為了降低酶的生產(chǎn)成本，美國(guó)能源局2002年為諾維信和杰能科提供資金，開發(fā)新型纖維素酶。2012年作為全球生物燃料生產(chǎn)用酶的最大供應(yīng)商丹麥諾維信推出最新酶制劑產(chǎn)品Cellic CTec3（纖維素酶），最大限度地提高了纖維素酶的發(fā)酵活力，降低了成本，確保工廠以最低的總成本生產(chǎn)纖維素乙醇。

作為新型清潔燃料，纖維素乙醇由于能替代傳統(tǒng)的以糧食作物為原料的生物乙醇技術(shù)，緩解能源危機(jī)、保護(hù)環(huán)境而已得到世界各國(guó)政府、企業(yè)及研究機(jī)構(gòu)的關(guān)注。自上世紀(jì)80年代中期，加拿大就開始資助纖維素乙醇研究和開發(fā)，logen公司利用麥稈、玉米稈生產(chǎn)纖維素乙醇。美國(guó)對(duì)纖維素乙醇項(xiàng)目給予政策及資金上的支持，2007年立法指令“要求到2022年每年必須提供160億加侖（美制加侖：1加侖=3.785 412 L；英制加侖：1加侖=4.546 092 L）的纖維素乙醇”，2008年“農(nóng)場(chǎng)法案”更是為纖維單質(zhì)生物燃料的發(fā)展提供了強(qiáng)有力的支持。意大利的M&G集團(tuán)開發(fā)的一體化纖維素乙醇生產(chǎn)技術(shù)，在歐洲已建成年產(chǎn)4萬(wàn)噸的纖維素乙醇的工業(yè)化示范裝置。

我國(guó)在“863計(jì)劃”中將纖維素乙醇列為研究課題。中糧集團(tuán)生化能源（肇東）公司，系統(tǒng)地研究了玉米秸稈為原料的纖維素乙醇生產(chǎn)工藝，并在2006年4月在黑龍江建成了一套年產(chǎn)500 t的纖維素乙醇試驗(yàn)裝置。該試驗(yàn)裝置以玉米秸稈為原料，采用丹麥諾維信公司的纖維素酶制劑，成功地生產(chǎn)出纖維素乙醇。山東澤生生物科技有限公司與中國(guó)科學(xué)院過(guò)程工程研究所建立了年產(chǎn)3 000 t的纖維素乙醇示范工程。河南天冠燃料乙醇有限公司以玉米秸稈為原料，生產(chǎn)纖維素乙醇，年產(chǎn)量已達(dá)30萬(wàn)噸。