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篇1

1 神經(jīng)行為學(xué)在藥理評價(jià)中的應(yīng)用

1.1 抗腦卒中藥物的評價(jià)

一般用運(yùn)動行為實(shí)驗(yàn)對腦栓塞動物模型（如大鼠）進(jìn)行卒中后運(yùn)動和協(xié)調(diào)能力的評價(jià)，從而判定藥物是否對腦卒中后神經(jīng)損傷恢復(fù)有效。運(yùn)動整合及協(xié)調(diào)能力實(shí)驗(yàn)主要包括：平衡木實(shí)驗(yàn)、轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)、肌力實(shí)驗(yàn)、網(wǎng)屏實(shí)驗(yàn)、肢體對稱實(shí)驗(yàn)、肢體放置實(shí)驗(yàn)、前肢放置檢測、平行杠實(shí)驗(yàn)、爬繩實(shí)驗(yàn)、爬梯實(shí)驗(yàn)、前爪伸屈實(shí)驗(yàn)、步態(tài)分析實(shí)驗(yàn)等。然而，大腦尾狀核、皮層和紋狀區(qū)對運(yùn)動 - 感覺信息的處理和整合起一定作用，這些區(qū)域在大腦中動脈梗死后很容易受損，并累及周圍區(qū)域如肢體的皮層、額葉和顳葉。因此，目前認(rèn)為缺血損傷后動物模型的神經(jīng)行為學(xué)評價(jià)除了評估一般感覺運(yùn)動功能，還應(yīng)該將認(rèn)知實(shí)驗(yàn)加入評估中。有證據(jù)表明，卒中后認(rèn)知缺陷可持續(xù)超過一般的感覺運(yùn)動缺陷。認(rèn)知實(shí)驗(yàn)主要包括 Morris 水迷宮、放射狀迷宮和 T 迷宮。

腦卒中動物模型在不同時(shí)期的行為學(xué)表現(xiàn)不同，因此行為學(xué)評價(jià)抗腦卒中藥物，相關(guān)行為學(xué)指標(biāo)表現(xiàn)出的敏感性，同時(shí)也存在著廣泛的偏差，組織學(xué)檢查結(jié)果和行為學(xué)實(shí)驗(yàn)相關(guān)，另一些則無關(guān)或相反。因此，當(dāng)前的評價(jià)方法尚不能全面的反映腦卒中的生理病理狀態(tài)，這就需要對模型生理病理指標(biāo)與行為學(xué)指標(biāo)相關(guān)性進(jìn)行研究，綜合多種方法進(jìn)行評估，尋找最敏感穩(wěn)定的行為學(xué)指標(biāo)。

1.2 抗精神病藥物的評價(jià)

焦慮模型主要分為 2 類：非條件反射模型和條件反射模型。其中比較經(jīng)典的研究方法基于動物有畏懼空曠場地的天性和其活動具有趨避性而建立的曠場實(shí)驗(yàn)、避暗實(shí)驗(yàn)、高架十字迷宮和 Vogels 飲水沖突模型。

目前抑郁癥行為學(xué)評價(jià)方法主要包括強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)、懸尾實(shí)驗(yàn)、空場實(shí)驗(yàn)、獲得性無助實(shí)驗(yàn)、新奇抑制攝食實(shí)驗(yàn)、糖水偏愛實(shí)驗(yàn)、間斷性行為實(shí)驗(yàn)、睡眠干擾實(shí)驗(yàn)等。其中，動物強(qiáng)迫性游泳和懸尾測試是評價(jià)抗抑郁藥作用最常用的方法，因其快速、方便、對多種抗抑郁藥物有效，被廣為接受和應(yīng)用。然而，也有學(xué)者認(rèn)為動物漂浮既可以是抑郁的表現(xiàn)，也可以是一種適應(yīng)機(jī)制，動物以此節(jié)約能量，漂浮更長的時(shí)間，以維持更長的存活時(shí)間。

由于應(yīng)激是導(dǎo)致焦慮和抑郁發(fā)生的重要原因之一，應(yīng)激對心理情感、認(rèn)知功能及反應(yīng)判斷能力等行為活動均產(chǎn)生影響，研究應(yīng)激致動物行為方法主要有社會交互實(shí)驗(yàn)，動物可出現(xiàn)社會逃避及興趣缺失的抑郁樣行為，此外還有動物束縛實(shí)驗(yàn)、糖水偏愛實(shí)驗(yàn)、條件性防御掩埋實(shí)驗(yàn)、聽覺驚跳實(shí)驗(yàn)等。

1.3 抗衰老藥物的評價(jià)

神經(jīng)退行性病變是由于神經(jīng)元進(jìn)行性變性死亡導(dǎo)致的以中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害為主的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，與年齡相關(guān)的大腦退行性變化是大腦中樞神經(jīng)系統(tǒng)在生長、發(fā)育、成熟之后走向衰老過程中而表現(xiàn)的生物老化的正常生理現(xiàn)象。其最突出的臨床表現(xiàn)是記憶和學(xué)習(xí)能力下降，因此抗衰老藥物行為學(xué)評價(jià)主要考察對學(xué)習(xí)記憶障礙的作用。主要研究方法包括空間記憶和非空間記憶，在空間學(xué)習(xí)記憶中，采用 Morris 水迷宮、八臂迷宮、T 型迷宮、輻射式迷宮等方法。近年來新的認(rèn)知方法出現(xiàn)，可以對空間學(xué)習(xí)記憶和非空間學(xué)習(xí)記憶進(jìn)行測試，如物體認(rèn)知測試系統(tǒng)，包含新物體的識別、新物置識別以及情景記憶和時(shí)序記憶。其中新物體的識別、情景記憶和時(shí)序記憶屬于空間記憶；新物置識別屬于非空間記憶。在條件反射方法中，非條件刺激可以是懲罰性的也可以是獎勵性的。使用懲罰性條件刺激的行為檢測方法如穿梭、跳臺、避暗等已被廣泛應(yīng)用于學(xué)習(xí)記憶和鞏固相關(guān)行為研究。但這些方法檢測的學(xué)習(xí)記憶能力大多是基于對環(huán)境刺激的被動反應(yīng)，而且需要給予懲罰性 / 傷害性刺激使動物完成學(xué)習(xí)記憶，對動物的生理及心理影響較大，同時(shí)影響神經(jīng)遞質(zhì)的釋放。而利用獎勵物質(zhì)的獎賞效應(yīng)，大腦會向負(fù)責(zé)決策的區(qū)域發(fā)送獎賞信號，形成好的記憶。獎賞效應(yīng)能使機(jī)體的認(rèn)知能力進(jìn)一步提升，形成良性循環(huán)，易化條件反射的形成。

1.4 其他藥物的評價(jià)

神經(jīng)行為學(xué)方法除了主要用于以上藥物的評價(jià)，還用于抗疲勞藥物、促進(jìn)睡眠藥物以及鎮(zhèn)痛藥物的評價(jià)中，抗疲勞藥物大多具有興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用，行為學(xué)檢測主要采用游泳實(shí)驗(yàn)、轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)。促進(jìn)睡眠藥物主要采用閾下催眠實(shí)驗(yàn)。鎮(zhèn)痛藥物根據(jù)作用部位不同可分為中樞鎮(zhèn)痛藥和外周鎮(zhèn)痛藥，用于評價(jià)外周藥物鎮(zhèn)痛作用的方法主要有小鼠醋酸扭體實(shí)驗(yàn)；評價(jià)中樞鎮(zhèn)痛藥物的方法熱板法、熱輻射甩尾實(shí)驗(yàn)以及福爾馬林測痛實(shí)驗(yàn)，目前新的研究方法有步態(tài)行為測試，通過研究動物運(yùn)動的步態(tài)及足底壓力評價(jià)藥物的治療作用。

2 神經(jīng)行為學(xué)在藥物安全性評價(jià)的應(yīng)用

2.1 在一般毒性評價(jià)中的應(yīng)用

神經(jīng)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)可以發(fā)現(xiàn)一些神經(jīng)毒性的相關(guān)終點(diǎn)，長期毒性實(shí)驗(yàn)中增加對特異性終點(diǎn)的評價(jià)，可以提高實(shí)驗(yàn)動物的利用率，縮短危險(xiǎn)評價(jià)所用的時(shí)間，并獲得額外的數(shù)據(jù)。如評價(jià)抗抑郁藥物的長期毒性實(shí)驗(yàn)可增加對動物自主活性的觀察指標(biāo)。而在一些不確定是否有神經(jīng)毒性的創(chuàng)新藥物評價(jià)中，神經(jīng)毒性篩查也可與長期毒性實(shí)驗(yàn)相組合，篩查的目的在于確定是否需要進(jìn)行附加的更加深入的神經(jīng)毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)，如步態(tài)異常有助于毒性部位的確定，例如下運(yùn)動神經(jīng)元疾病可致跨越步態(tài)；剪形步態(tài)和僵硬步態(tài)說明上運(yùn)動神經(jīng)元損害；小腦功能不良可致共濟(jì)失調(diào)及步態(tài)蹣跚。關(guān)于神經(jīng)系統(tǒng)的毒性特征，猶如靶器官毒性一樣，能隨染毒期限的長短表現(xiàn)不同。神經(jīng)毒性作用的意義取決于它的可逆性，一般來說，不可逆作用較可逆作用嚴(yán)重，神經(jīng)系統(tǒng)的區(qū)域?qū)ι砉δ苡绊戄^其他系統(tǒng)更為重要。

2.2 在安全性藥理評價(jià)中的應(yīng)用

由于毒物對神經(jīng)系統(tǒng)的作用范圍很廣，一般采用功能組合實(shí)驗(yàn)來評價(jià)藥物對神經(jīng)系統(tǒng)的安全性。目前動物神經(jīng)行為測試還沒有一套標(biāo)準(zhǔn)模式的神經(jīng)行為功能測試組合，只是經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織（OECD）在感覺、運(yùn)動、認(rèn)知等方面推薦了一些測試方法，綜合評價(jià)被測化學(xué)物質(zhì)的神經(jīng)行為毒性。國家食品藥品監(jiān)督管理總局（CFDA）規(guī)定中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥物安全性評價(jià)可定性和定量評價(jià)給藥后動物的運(yùn)動功能、行為改變、協(xié)調(diào)功能、感覺 / 運(yùn)動反射和體溫的變化等，以確定藥物對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的影響。當(dāng)核心組合實(shí)驗(yàn)及文獻(xiàn)報(bào)道提示藥物存在潛在的與人體安全性有關(guān)的不良反應(yīng)時(shí)，應(yīng)進(jìn)行追加和 /或補(bǔ)充的安全藥理學(xué)研究。追加的安全藥理實(shí)驗(yàn)是除了核心組合實(shí)驗(yàn)外，反映受試物對中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)的深入研究。如追加的安全藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的影響包括對行為、學(xué)習(xí)記憶、神經(jīng)生化、視覺、聽覺和 / 或電生理等指標(biāo)的檢測。

2.3 藥物依賴性的評價(jià)

幾乎所有的依賴性藥物，如阿片、酒精、可卡因、苯丙胺、尼古丁等都會使濫用成癮者戒斷后出現(xiàn)情緒問題，包括抑郁、焦慮、缺乏等，是藥物依賴患者急性或慢性戒斷期常見的特征，也是引起藥物依賴者對藥物產(chǎn)生心理依賴和復(fù)吸的重要原因。藥物依賴與沖動行為有著密切的聯(lián)系，藥物依賴能夠使沖動行為發(fā)生變化；同時(shí)可以誘導(dǎo)動機(jī)獎賞系統(tǒng)及學(xué)習(xí)記憶相關(guān)腦區(qū)內(nèi)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)發(fā)生可塑性改變，該變化在停藥后仍可長期存在。對于精神依賴性由于是機(jī)體對藥物內(nèi)在的感知綜合體現(xiàn)，如動物心理滿足感、欣，同時(shí)，本身沖動性不同的個體對依賴藥物的易感性存在個體差異。實(shí)驗(yàn)評價(jià)難度較大，目前評價(jià)方法主要結(jié)合抑郁、焦慮、學(xué)習(xí)記憶等神經(jīng)行為學(xué)方法進(jìn)行研究，其中應(yīng)用較多的是操作式行為實(shí)驗(yàn)方法，如獎賞實(shí)驗(yàn)及采用自身給藥模擬人的覓藥行為和藥物辨別行為，因該方法需要儀器設(shè)備復(fù)雜，實(shí)驗(yàn)周期較長。目前廣泛用于藥物精神依賴的評價(jià)方法是條件位置偏愛實(shí)驗(yàn)，該方法經(jīng)濟(jì)簡便。

2.4 在發(fā)育神經(jīng)毒性評價(jià)中的應(yīng)用

發(fā)育神經(jīng)毒性（DONT）評價(jià)是藥物臨床前安全性評價(jià)的重要組成部分，是指個體在發(fā)育過程中暴露于某些神經(jīng)毒性物質(zhì)后引起的神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能的異常改變，進(jìn)而引起個體的感覺、運(yùn)動及各種認(rèn)知功能改變，表現(xiàn)為個體發(fā)育產(chǎn)生某些缺陷。常見的有行為改變、智力低下、精神失常、孤僻癥等。神經(jīng)毒性藥物評價(jià)通常與生殖發(fā)育毒性研究相結(jié)合，以母體染毒對仔代或在仔代實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)測試。目前常用的研究動物為大鼠。但是，非人靈長類因與人的行為活動最為相似，是研究發(fā)育神經(jīng)毒性最適合的動物。非人靈長類神經(jīng)行為學(xué)的測試方法包括學(xué)習(xí)能力、記憶能力、計(jì)劃控制行為、情緒行為能力、信息處理能力、社會行為、感知功能、視動協(xié)調(diào)能力以及視覺空間定位能力等測試。其中使用照片、幻燈片、計(jì)算機(jī)化圖象及視頻學(xué)習(xí)行為被越來越多地用在非人靈長類動物發(fā)育研究中。然而，由于這些介質(zhì)都被設(shè)計(jì)來模擬自然色彩，鑒于人類與非靈長類動物不同物種之間和內(nèi)部存在的色彩感覺的差異，有必要考慮識別這些介質(zhì)的適用性變化，使用的攝影和錄像的刺激應(yīng)該在復(fù)制自然的顏色接近該物種的視覺感官。研究藥物對靈長類動物的發(fā)育毒性行為變化可以為人類精神發(fā)育病理學(xué)提供獨(dú)特的見解。

篇2

[關(guān)鍵詞] 感染性腦損傷；橙皮苷；強(qiáng)迫游泳

[中圖分類號] R-33 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-4721（2013）11（c）-0031-02

Influce of hesperidin on forced swimming test of mice with cerebral injury induced by LPS

WU Jian1 LIU Hong-zhi1 WEN Xiang-ru2 FU Yan-yan1 ZHANG Lei3 SUN Ying3 ZHANG Fang1 LIU Yong-min2 DONG Hong-yan1 LIU Yong-hai3 SONG Yuan-jian1

1.Neurobiology Research Center， Basic Courses School of Xuzhou Medical College in Jiangsu Province， Xuzhou 221004， China；2.Teaching and Research Section of Chemistry， Public Education School of Xuzhou Medical College in Jiangsu Province， Xuzhou 221004， China；3.Department of Neurology， Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College in Jiangsu Province， Xuzhou 221004， China

[Abstract] Objective To investigate the influence of hesperidin on forced swimming test of mice with cerebral injury induced by lipopolysaccharide （LPS）. Methods 45 ICR mice at 3 weeks were evenly divided into saline group， LPS group and LPS + hesperidin group （Hesp） in random. Mice from 3 groups in accumulative distance and cumulative time within 5 minutes′ swimming were tested by ZH-QPT forced swimming test video analysis system. Results Compared with saline group， the accumulative distance of swimming in LPS group was obviously shorter， but there was no significant change in cumulative time in the two groups. In comparison with the LPS group， the accumulative distance of swimming in LPS+Hesp group became longer， but without obvious changes in cumulative time. Conclusion Hesperidin can remarkably prolong the distance in forced swimming test in mice with infectious cerebral injury.

[Key words] Infectious cerebral injury； Hesperidin； Forced swimming

腦部細(xì)菌或病毒感染是導(dǎo)致新生兒、幼兒腦損傷的重要原因之一。腦損傷后常遺留運(yùn)動功能障礙、認(rèn)知行為障礙等神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥[1]。因此，探究感染性腦損傷后行為學(xué)指標(biāo)的改變有重要意義。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的主要成分，為脂質(zhì)和多糖的復(fù)合物，屬內(nèi)毒素，具有神經(jīng)毒性。幼年小鼠的血-腦脊液屏障（blood brain barrier，BBB）尚不健全，LPS會造成小鼠感染性腦損傷。可應(yīng)用LPS建立小鼠的感染性腦損傷模型，并借助這一模型研究感染性腦損傷后行為學(xué)指標(biāo)的改變。橙皮苷（hesperidin，Hesp）在柑桔類植物的果實(shí)中廣泛存在，具有多種功能，如抗炎、鎮(zhèn)痛、抗氧化、抗癌等[2-3]，另有很好的神經(jīng)保護(hù)作用[4]。它是否會影響感染性腦損傷動物的行為，目前未見報(bào)道。

強(qiáng)迫游泳行為學(xué)實(shí)驗(yàn)可用于初步研究神經(jīng)或精神類藥物的作用，也可初步篩選相關(guān)藥物[5]。通過強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)，考察LPS誘導(dǎo)的感染性腦損傷小鼠的行為學(xué)變化，以及橙皮苷對該行為學(xué)變化的影響，有助于認(rèn)識和理解腦損傷導(dǎo)致的行為變化規(guī)律，為感染性腦損傷的診斷、治療和康復(fù)提供新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

LPS購自Sigma公司，Hesp購自鄭州荔諾生物科技有限公司；強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)設(shè)備采用淮北正華公司的ZH-QPT型強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)視頻分析系統(tǒng)，硬件系統(tǒng)尺寸為直徑10 cm，高30 cm；記錄分析軟件采用Stoelting公司的Any-maze system，版本為4.72版。

1.2動物及分組

3周齡、雄性健康ICR小鼠45只，體重為8～11 g，由徐州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。將小鼠隨機(jī)分為3組，每組15只：生理鹽水（saline）組，腹腔注射生理鹽水；LPS組，腹腔注射LPS；Hesp組，即先用LPS處理，后給予Hesp。

1.3方法

1.3.1 動物模型制備 saline組小鼠腹腔注射生理鹽水；LPS組腹腔注射LPS生理鹽水溶液，劑量為5 mg/kg；LPS+Hesp組先腹腔注射LPS（5 mg/kg），0.5 h后Hesp（劑量為200 mg/kg，混懸于0.5%羥甲基纖維素鈉水溶液中）灌胃。將以上各組小鼠6 h后置于ZH-QPT型強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)視頻分析系統(tǒng)中觀察并記錄其行為學(xué)指標(biāo)。

1.3.2 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)行為研究 實(shí)驗(yàn)環(huán)境的水溫20～25℃，首先將小鼠置于水中適應(yīng)2 min，再記錄隨后5 min的行為，用Any-maze system軟件記錄分析活動指標(biāo)，包括活動路程、累積活動時(shí)間及累積靜止時(shí)間。

1.3.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以x±s表示，組間比較采用方差分析，以P

2結(jié)果

saline組小鼠在5 min內(nèi)游動了（14.49±4.08）m，LPS處理后，小鼠游動路程大幅縮短，僅（6.96±1.74）m，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P

表1 各組小鼠在強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)視頻分析系統(tǒng)中的活動路程、累積游動時(shí)間和累積靜止時(shí)間的比較（x±s）

與saline組比較，aP

圖1 小鼠強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)視頻分析系統(tǒng)中的狀態(tài)圖

A.靜止?fàn)顟B(tài)；B.活動狀態(tài)

3 討論

腦損傷中，除創(chuàng)傷性損傷外，感染性腦損傷、漸進(jìn)性腦損傷的發(fā)生、進(jìn)展的機(jī)制多樣而復(fù)雜。感染性腦損傷常見于新生兒和幼兒，腦損傷可能導(dǎo)致幼兒精神神經(jīng)異常和行為障礙，治療困難[6]，康復(fù)往往采用高壓氧等方法[7]，常會導(dǎo)致患兒認(rèn)知障礙、精神神經(jīng)行為異常。幼年小鼠的血-腦脊液屏障不健全，本研究用LPS處理雄性ICR小鼠，建立了感染性腦損傷模型。

除強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)外，研究動物的行為變化還可采用曠場實(shí)驗(yàn)、水迷宮實(shí)驗(yàn)、懸尾實(shí)驗(yàn)等，強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)是最早用于研究抑郁類行為的方法[8]，結(jié)果可靠性強(qiáng)。不同性別小鼠的強(qiáng)迫游泳行為不同[9]，本研究討論雄性ICR小鼠的強(qiáng)迫游泳行為。溫度等理化因素對實(shí)驗(yàn)動物的強(qiáng)迫游泳行為也有影響，本研究控制實(shí)驗(yàn)水溫為20～25℃。結(jié)果表明感染性腦損傷小鼠在強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中行為異常，雖然累積靜止時(shí)間沒有變化，但是活動路程顯著降低。

Hesp是治療心血管病的藥物，是多效藥物，有研究表明其有神經(jīng)保護(hù)作用，但作用機(jī)制不明，對動物的行為學(xué)有何影響，目前未見報(bào)道。本研究通過強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Hesp可以逆轉(zhuǎn)LPS對小鼠游泳行為的影響，在維持累積靜止時(shí)間不變的同時(shí)，顯著增加活動路程。

因此，從強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，Hesp可以有效減輕LPS誘導(dǎo)的小鼠游泳行為障礙，其中所涉及的分子機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)室正在進(jìn)一步研究。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 梁艷苓，陳翔.早期認(rèn)知功能發(fā)育與嬰兒腦損傷[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2009，6（13）：5-7.

[2] Ahmad ST，Arjumand W，Nafees S，et al.Hesperidin alleviates aceta-

minophen induced toxicity in Wistar rats by abrogation of oxidative stress，apoptosis and inflammation[J].Toxicol Lett，2012，208（2）：149-161.

[3] Lee KH，Yeh MH，Kao ST，et al.The inhibitory effect of hesperidin on tumor cell invasiveness occurs via suppression of activator protein 1 and nuclear factor-κB in human hepatocellular carcinoma cells[J]. Toxicol Lett，2010，194（1-2）：42-49.

[4] Hwang SL，Yen GC.Neuroprotective effects of the citrus flavanones against H2O2-induced cytotoxicity in PC12 cells[J]. J Agric Food Chem，2008，56（3）：859-864.

[5] Petit-Demouliere B，Chenu F，Bourin M.Forced swimming test in mice：a review of antidepressant activity[J]. Psychopharmacology （Berl），2005，177（3）：245-255.

[6] 溫小蓮，梁衛(wèi)權(quán)，王小東，等.臨床護(hù)理路徑在36例重度腦損傷患兒中的應(yīng)用分析[J].中國當(dāng)代醫(yī)藥，2012，19（29）：110-111.

[7] 劉克洪，李景琦，余丹，等.腦損傷意識障礙患者的康復(fù)治療[J].中國當(dāng)代醫(yī)藥，2012，19（14）：42-43.

[8] Potsolt RD，Le Pichon M，Jalfre M.Depression：a newanimal model sensitive to antidepressant treatments[J].Nature，1977，266（5604）：730-732.

篇3

關(guān)鍵詞：帕金森病；大鼠；6-羥基多巴胺

帕金森?。≒D）是常見的中老年人中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其病因及發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚， 研究認(rèn)為可能與遺傳、環(huán)境因素、線粒體功能障礙、興奮性氨基酸、氧化應(yīng)激、過多的自由基形成及神經(jīng)生長因子缺乏等有關(guān)，是多種機(jī)制協(xié)同作用的結(jié)果[1-2]。偏側(cè)6-OHDA損毀模型是目前使用最多的PD動物模型之一，其在癥狀、病理、生化方面的表現(xiàn)與人類PD有不少相似之處，但該模型的損傷程度因6-OHDA的劑量、濃度、注射位點(diǎn)不同而存有爭議，特別是對損傷早期大鼠行為學(xué)方面的觀察比較缺乏。本實(shí)驗(yàn)通過觀察6-OHDA損傷早期PD大鼠行為學(xué)及黑質(zhì)部位組織學(xué)的變化特點(diǎn)，驗(yàn)證損傷早期PD大鼠模型的穩(wěn)定性及可靠性。

1資料與方法

1.1一般資料 選用健康雄性SD大鼠40只， 體重 250～300 g，由南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。6-OHDA、抗壞血酸干粉劑、鹽酸阿樸嗎啡（apomorphine）、抗酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase， TH）抗體均購于Sigma公司。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)動物分組 40只SD大鼠隨機(jī)分為三組：①空白對照組（n=8）；②6-OHDA模型組（n=24）：分為24 h組（n=8）、7 d組（n=8）和28 d組（n=8）3個亞組；③假手術(shù)組（n=8）。

1.2.2動物模型 模型組大鼠用復(fù)合麻醉劑（含戊巴比妥鈉、丙二醇、硫酸鎂等，0.25 mL/100 g體重）腹腔注射麻醉，待大鼠后肢回縮反射及角膜反射消失后，將其頭部水平位固定在腦立體定位儀上，剪除顱頂鼠毛，碘酒、酒精消毒皮膚，沿中線切開一長約2cm切口，充分暴露前囟，參照Paxinos & Watson（1996）《大鼠腦立體定位圖譜》確定左側(cè)前腦內(nèi)側(cè)束（mfb）三維坐標(biāo)位置，選取mfb區(qū)坐標(biāo)：前囟后2.8 mm，中線左側(cè)2.0 mm，硬膜下8.2 mm。根據(jù)注射位點(diǎn)確定鉆顱部位，手術(shù)刀尖小心鉆開一直徑約2 mm顱骨孔，微量進(jìn)樣器緩慢進(jìn)針至靶點(diǎn)，留針10 min，以9 ng/s的速度注入2 μg/μL 6-OHDA 4 μL（含0.02%抗壞血酸），注射完畢后留針5min，以1mm/min的速度退針。手術(shù)完畢，用明膠海綿堵塞顱骨孔，適量青霉素涂敷創(chuàng)口，消毒縫合皮膚，放回籠中飼養(yǎng)。并于24 h、7 d、28 d分別檢測大鼠行為學(xué)和組織學(xué)的改變。假手術(shù)組同法予含0.02%抗壞血酸的生理鹽水4 μL，空白對照組不作任何處理。

1.2.3行為學(xué)檢測

1.2.3.1跨步調(diào)節(jié)試驗(yàn)[3] 將大鼠身體的后半部分拖起 ，并使大鼠身體重量僅由一側(cè)前肢支撐 ，記錄10s內(nèi)大鼠這一前肢走步次數(shù) ，然后同法檢測另一前肢的情況，以損傷對側(cè)前肢行走次數(shù)所占比例（損傷對側(cè)前肢行走次數(shù)/（損傷對側(cè)前肢行走次數(shù)+損傷側(cè)前肢行走次數(shù)））為評價(jià)指標(biāo)。

1.2.3.2姿勢不對稱性試驗(yàn)[4] 握住鼠尾的中后部將其提起，懸空于實(shí)驗(yàn)臺上方約10 cm處，使大鼠頭向下處于垂直狀態(tài)， 以其偏離垂直軸不超過10°為垂直位（標(biāo)準(zhǔn)位），記錄大鼠頭或上身左右擺動的情況，以擺動偏離垂直位并再返回到垂直位記數(shù)為1次。觀察45 s內(nèi)大鼠頭或身體轉(zhuǎn)動的方向和次數(shù)，以向損傷對側(cè)擺動的次數(shù)所占比例（損傷對側(cè)擺動的次數(shù)/（損傷對側(cè)擺動的次數(shù)+損傷側(cè)擺動的次數(shù)））為評價(jià)指標(biāo)。

1.2.3.3阿撲嗎啡誘發(fā)旋轉(zhuǎn)試驗(yàn) 模型組分別于術(shù)后24 h、7 d、28 d于動物腹腔內(nèi)注射阿撲嗎啡0.5 mg/Kg 誘發(fā)大鼠向右側(cè)（健側(cè)）旋轉(zhuǎn)，于阿撲嗎啡注射后5 min開始記錄，持續(xù)記錄30 min。以24 h誘發(fā)旋轉(zhuǎn)次數(shù)210次/30 min為合格模型。

1.2.4組織學(xué)檢測

1.2.4.1動物灌注、固定、取材、切片 各組大鼠在最后一次行為學(xué)檢測后，用復(fù)合麻醉劑麻醉，剪開大鼠胸腔，經(jīng)主動脈快速灌注生理鹽水（37℃）150～200 mL沖洗，至大鼠肝臟發(fā)白，流出液基本無色為止。隨即灌注4%甲醛（4℃）先快速灌注 200 mL，再緩慢灌注300 mL，至頭與四肢均已發(fā)硬。斷頭取腦，置于4%甲醛，放4℃冰箱固定4 h，再依次置入20%及30%蔗糖磷酸鹽緩沖液內(nèi)，存4℃冰箱至腦塊沉入瓶底。取中腦黑質(zhì)組織塊進(jìn)行冠狀連續(xù)冰凍切片，片厚20 μm。

1.2.4.2抗TH染色 作漂片SABC法染色，具體步驟依次為：冰凍切片用0.01 M（pH7.4）磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗3次，5 min/次。0.3% H2O2抑制內(nèi)源性過氧化物酶活性， 0.02 mol/L EDTA（95℃）復(fù)性（2 min），非免疫的正常羊血清，室溫下孵育30 min，抗TH抗體（1∶1000，抗體稀釋液稀釋），37℃孵育4 h， SABC試劑，室溫下孵育1 h， DAB顯色（陽性產(chǎn)物為棕黃色）。以上各步驟之間均以0.01M（PH7.4）PBS漂洗3次，5 min/次，正常羊血清與抗TH抗體孵育之間不漂洗。顯色后貼片，自然風(fēng)干，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.2.4.3 TH陽性神經(jīng)元記數(shù) 各組大鼠取包含黑質(zhì)致密部最明顯的中腦切片，在×100倍顯微鏡下計(jì)數(shù)兩側(cè)黑質(zhì)有完整細(xì)胞體的TH陽性細(xì)胞，計(jì)算左側(cè)與右側(cè)黑質(zhì)TH陽性細(xì)胞數(shù)的百分比（左側(cè)黑質(zhì)TH陽性細(xì)胞數(shù)/右側(cè)黑質(zhì)TH陽性細(xì)胞數(shù)×100% ）。參照蔡文琴等[5]介紹的神經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)方法進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)結(jié)果均使用 SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。單因素方差分析進(jìn)行差異性檢驗(yàn)，P

2結(jié)果

2.1行為學(xué)觀察 對照組及假手術(shù)組大鼠經(jīng)阿撲嗎啡誘發(fā)后無旋轉(zhuǎn)行為，也未出現(xiàn)非藥物誘發(fā)的行為學(xué)改變。模型組大鼠在注射6-OHDA后數(shù)小時(shí)即出現(xiàn)損毀側(cè)肢體動作減少，身體重心偏向損毀側(cè)，并出現(xiàn)身體向損毀側(cè)緩慢旋轉(zhuǎn)，不能進(jìn)行直線或隨意爬行。

2.1.1跨步調(diào)節(jié)試驗(yàn) 對照組及假手術(shù)組大鼠兩側(cè)前肢10 s內(nèi)跨步次數(shù)基本相同，模型組大鼠在左側(cè)前腦內(nèi)側(cè)束注射6-OHDA后24 h跨步調(diào)節(jié)試驗(yàn)評分出現(xiàn)有意義減少，7 d及28 d評分進(jìn)一步減少，見表1。

2.1.2姿勢不對稱試驗(yàn) 在左側(cè)前腦內(nèi)側(cè)束注射6-OHDA后24 h，姿勢不對稱試驗(yàn)結(jié)果顯示模型組大鼠頭部和身體出現(xiàn)向右側(cè)轉(zhuǎn)動次數(shù)有意義增加，7 d及28 d姿勢不對稱試驗(yàn)評分進(jìn)一步增加，對照組及假手術(shù)組大鼠頭部和身體向兩側(cè)轉(zhuǎn)動次數(shù)大致相同，見表2。

2.1.3阿撲嗎啡誘發(fā)旋轉(zhuǎn)試驗(yàn) 在注射6-OHDA后24 h，阿撲嗎啡腹腔注射誘發(fā)大鼠以右側(cè)后肢為支點(diǎn)，首尾相接向右側(cè)旋轉(zhuǎn)，30 min旋轉(zhuǎn)次數(shù)210次/30 min，對照組及假手術(shù)組大鼠未誘發(fā)出旋轉(zhuǎn)行為，見表3。

2.2組織學(xué)檢測 抗TH染色結(jié)果顯示，在左側(cè)前腦內(nèi)側(cè)束注射6-OHDA后24 h，大鼠左側(cè)黑質(zhì)TH陽性神經(jīng)元數(shù)目出現(xiàn)有意義減少，高倍鏡下見少部分神經(jīng)元出現(xiàn)胞體腫脹、核膜界限消失等變性征象，部分神經(jīng)軸突斷裂、錯亂；7 d和28 d時(shí)大鼠左側(cè)黑質(zhì)TH陽性神經(jīng)元幾乎消失，殘留的TH神經(jīng)元表現(xiàn)出染色質(zhì)濃縮壞死現(xiàn)象，神經(jīng)軸突散在稀疏；模型組大鼠右側(cè)黑質(zhì)TH陽性神經(jīng)元數(shù)目同時(shí)也有部分減少；對照組及假手術(shù)組大鼠兩側(cè)黑質(zhì)TH陽性神經(jīng)元無明顯改變，見表4，圖1。

3討論

研究PD需要建立穩(wěn)定可靠的模型。6-OHDA是一種選擇性中樞兒茶酚胺能神經(jīng)元毒性物質(zhì)，具有很強(qiáng)的呼吸鏈抑制作用，偏側(cè)6-OHDA損毀模型是目前使用最多的PD模型之一。1970年Ungerstedl[6]首先報(bào)道了應(yīng)用6-OHDA成功制備大鼠偏側(cè)PD模型，這種模型能夠在多巴胺能藥物的誘發(fā)下產(chǎn)生旋轉(zhuǎn)行為，以便于判斷模型成功與否。阿撲嗎啡是多巴胺（dopamine，DA）受體激動劑，能夠引起該模型向健側(cè)旋轉(zhuǎn)，這是由于損傷側(cè)紋狀體多巴胺含量下降，多巴胺D2受體代償性大量增加，且敏感性增高，出現(xiàn)超敏現(xiàn)象[7]，此時(shí)應(yīng)用DA受體激動劑使損傷側(cè)興奮作用占優(yōu)勢而產(chǎn)生向健側(cè)旋轉(zhuǎn)。

PD的神經(jīng)保護(hù)治療需要早期進(jìn)行，評估6-OHDA損傷早期大鼠行為學(xué)變化，可進(jìn)一步明確模型是否成功及神經(jīng)保護(hù)性治療是否有效。阿撲嗎啡誘發(fā)旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)結(jié)合非藥物誘發(fā)的行為學(xué)試驗(yàn)，其評估結(jié)果更加有效、可靠[8]。在偏側(cè)前腦內(nèi)側(cè)束注射6-OHDA后數(shù)小時(shí)，大鼠出現(xiàn)肢體動作減少，身體重心偏向損毀側(cè)，并出現(xiàn)身體向損毀側(cè)不自主旋轉(zhuǎn)，不能進(jìn)行直線或隨意爬行，6-OHDA注射后24 h大鼠跨步調(diào)節(jié)試驗(yàn)和姿勢不對稱試驗(yàn)出現(xiàn)有意義改變，腹腔注射阿撲嗎啡后可誘導(dǎo)大鼠在原地向健側(cè)旋轉(zhuǎn)，以健側(cè)后肢為支點(diǎn)，首尾相接，形成環(huán)狀，但旋轉(zhuǎn)次數(shù)

偏側(cè)前腦內(nèi)側(cè)束注射6-OHDA后24 h大鼠出現(xiàn)行為學(xué)和組織學(xué)方面的變化，為檢測模型的穩(wěn)定性和可靠性，實(shí)驗(yàn)設(shè)立6-OHDA損傷后7d和28d組。結(jié)果顯示：大鼠行為學(xué)改變較24 h組更加顯著，阿撲嗎啡誘發(fā)旋轉(zhuǎn)次數(shù)>210次/30 min，符合成功PD模型標(biāo)準(zhǔn)；7 d和28 d時(shí)大鼠左側(cè)黑質(zhì)TH陽性神經(jīng)元減少90%。偏側(cè)前腦內(nèi)側(cè)束注射6-OHDA后，損傷對側(cè)有部分DA能神經(jīng)元丟失，可能與藥物的滲透作用或經(jīng)血液循環(huán)等有關(guān)。

綜上所述，通過早期行為學(xué)檢測，可為神經(jīng)保護(hù)性研究確立合格的PD模型，避免了藥物提前干預(yù)存在的藥物顯效與模型失敗之間的爭議。

參考文獻(xiàn)：

[1]Cookson M R. The Biochemistry of Parkinson's Disease [J]. Annu Rev Biochem， 2005， 74： 29-52.

[2]Levy O A， Malagelada C， Greene LA. Cell death pathways in Parkinson's disease： proximal triggers， distal effectors， and final steps [J]. Apoptosis， 2009， 14： 478-500.

[3]Olsson M， Nikkhah G， Bentlage C， et al. Forelimb akinesia in the rat Parkinson model：differential effects dopamine agonists and nigral transplants assessed by a new stepping test [J]. J Neuroecience， 1995， 15（5-2）： 3863-3875.

[4]Roghani M， Behzadi G， Baluchnejadmojarad T. Efficacy of elevated body swing testing the early model of Parkinson disease in rat [J]. Physiology & Behavior， 2002， 76（4-5）： 507-510.

[5]蔡文琴，王泊沄.實(shí)用免疫細(xì)胞化學(xué)及核酸分子雜交技術(shù)[M].成都：四川科學(xué)技術(shù)出版社，1994：180-191.

[6]Ugerstedl U， Arbuthnott G. Quantitative reording of rotational behavior in rats after 6-hydroxydopamine lesions of the nigrostriatal dopamine system [J]. Brain Res， 1970， 24： 485.

篇4

【摘要】 目的：探討中藥固本祛風(fēng)湯治療變應(yīng)性鼻炎（AR）豚鼠模型的療效以及對其行為學(xué)的影響。方法：將 90 只豚鼠隨機(jī)分成正常對照組、模型組、辛芩顆粒組和中藥治療組，以卵清蛋白致敏激發(fā)造成變應(yīng)性鼻炎豚鼠模型，分別給予中藥和辛芩顆粒，觀察各組動物的行為學(xué)改變。結(jié)果：中藥治療組癥狀顯著低于模型組，其差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。結(jié)論：固本祛風(fēng)湯可明顯改善變應(yīng)性鼻炎豚鼠模型的癥狀，從而發(fā)揮對 AR 的治療作用。

【關(guān)鍵詞】 變應(yīng)性鼻炎；豚鼠模型；固本祛風(fēng)湯；行為學(xué)

〔Abstract〕 Objective To study the effect of Chinese medicine GubenQufeng prescription treating guinea pig model of allergic rhinitis and its reaction on behavioristics. Methods 90 guinea pigs were randomly pided into normal control group， model group， Xinqin particles and the Chinese medicinegroup， sensitized to ovalbumin excitation caused guinea pig model of allergic rhinitis， were given medicine and Xinqin particles， behavioristics observed after treatment. Results Symptoms of Chinese medicine treatment group was significantly lower than that of model group， There was a statistically significant difference (P < 0.05). Conclusion

GubenQufeng prescription can significantly improve the guinea pig model of allergicrhinitis symptoms， thereby play a role in the treatment of AR.

〔Key Words〕

Allergic rhinitis; Guinea pig model; GubenQufeng prescription; Behavioristics

變應(yīng)性鼻炎（Allergic Rhinitis， AR）是由 IgE 介導(dǎo)的Ⅰ型超敏反應(yīng)性疾病，由于大氣污染等多種原因，近年來發(fā)病率不斷升高。變應(yīng)性鼻炎在中醫(yī)屬于“鼻鼽”范疇，歷代醫(yī)家對本病的認(rèn)識頗不一致，但都認(rèn)為其發(fā)病與外界因素有密切關(guān)系。筆者經(jīng)過多年的臨床實(shí)踐，認(rèn)為本病病機(jī)主要在于肺、脾、腎三臟的虛損，自擬固本祛風(fēng)湯對變應(yīng)性鼻炎患者進(jìn)行治療，在臨床上取得了顯著的療效。為進(jìn)一步探討固本祛風(fēng)湯對變應(yīng)性鼻炎治療的機(jī)制，我們將其用于卵清蛋白誘發(fā)的變應(yīng)性鼻炎豚鼠模型，用固本祛風(fēng)湯治療后觀察動物模型的行為學(xué)改變，為將其更好地用于臨床治療變應(yīng)性鼻炎提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1

材料和方法

1.1

實(shí)驗(yàn)動物

Hartley 豚鼠 90 只，清潔級，雌雄各半，體重 250~300 g，由中山醫(yī)科大學(xué)動物中心提供。在空調(diào)動物房飼養(yǎng)，溫度 25~28℃，濕度 40%~50%，飼養(yǎng)房避免過敏原存在，適應(yīng)性飼養(yǎng) 1 周后開始正式實(shí)驗(yàn)。

1.1.1

藥物和試劑

固本祛風(fēng)湯：制附子、黃芪、桂枝、全蟲、辛荑花、防風(fēng)、肉桂、徐長卿、茯苓、甘草。

辛芩顆粒：由上海中醫(yī)大藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)（國藥準(zhǔn)字 Z31020014）。

卵清蛋白（OVA）：由美國 Sigma 公司生產(chǎn)。

1.1.2

動物分組

將豚鼠隨機(jī)分為 6 個組：A 組（正常對照組），B 組（模型組），C 組（辛芩顆粒組），D 組（中藥低劑量組），E 組（中藥中劑量組），F(xiàn) 組（中藥高劑量組），每組 15 只。

1.1.3

造模方法

采用卵清蛋白致敏的方法[1-5]，對模型組和實(shí)驗(yàn)組豚鼠分別以每只腹腔注射卵清蛋白混懸液 1 mL（卵清蛋白 0.3 mg 為抗原，氫氧化鋁 30 mg 為佐劑，溶于 1 mL 生理鹽水配成），隔日 1 次，共 7 次。

1.1.4

模型評價(jià)

于末次鼻腔激發(fā)后第 2 日，分別在模型組、對照組和實(shí)驗(yàn)組隨機(jī)各選取 3 只，行 PCA 試驗(yàn)。即每只于球后靜脈叢采血 0.3 mL，離心（3 000 r/min）10 min 后分離出血清，取 40 L 生理鹽水稀釋，分別配成 1:4、1:16、1:64、1:256 濃度；取健康白色大鼠，背部剃毛，將上述不同濃度血清分別注射于背部皮下，間隔 2 cm，并作記號；72 h 后，以卵清蛋白 1 mg、伊文斯蘭 5 mg 溶于 1 mL 生理鹽水，于大鼠尾靜脈注射，30 min 后觀察結(jié)果，藍(lán)斑直徑超過 5 mm 為陽性，即造模成功。觀察造模成功后，每側(cè)鼻腔均以 2% 卵清蛋白溶液用微量加樣器滴入 40 L，每日 1 次，共 7 次。

1.1.5

給藥方法

經(jīng) PCA 試驗(yàn)藍(lán)斑呈陽性后，以 2% 卵清蛋白溶液滴鼻，從第 1 次 OVA 滴鼻當(dāng)日起，實(shí)驗(yàn)組和對照組于滴鼻前口飼給藥，中藥濃煎后用蒸餾水稀釋，調(diào)整濃度，使每只每天給藥量均為 3 mL；模型組和空白組每只每天予口飼 3 mL 生理鹽水。每日 1 次，共 7 次。

1.1.6

給藥劑量

實(shí)驗(yàn)組：低劑量組：每日 7.5 g/kg；中劑量組：每日 15 g/kg；高劑量組：每日 30 g/kg。

對照組：辛芩顆粒每日 6 g 生藥 / kg。

1.2

標(biāo)本采集

所有動物末次給藥后 1 h，于球后靜脈叢采血 3 mL，離心（3 000 r/min）15 min 后分離出血清，于-20℃ 保存。同時(shí)予 10% 水合氯醛溶液以 0.4 mL/kg 腹腔注射麻醉后，分離鼻骨前皮膚，咬除鼻骨，取下鼻中隔及其黏膜，于 4% 多聚甲醛溶液中固定。

1.3

指標(biāo)檢測

1.3.1

行為學(xué)觀察

記錄每次激發(fā)后 30 min 內(nèi)動物的鼻癢、噴嚏、清涕出現(xiàn)的時(shí)間、次數(shù)與輕重程度，并打分。評分標(biāo)準(zhǔn)：0 分：無噴嚏、抓鼻、喘息及鼻分泌物；1 分：噴嚏 < 4個，輕度抓鼻，喘息急促，前鼻孔有鼻分泌物；2 分：噴嚏 4~10 個，頻繁抓鼻，喘息加重，鼻分泌物超過前鼻孔；3 分：噴嚏 > 11 個，持續(xù)抓鼻，因喘息致死，臉部布滿鼻分泌物?？偡?> 5 分表示造模成功[6]。

1.4

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用 U 檢驗(yàn)或 t 檢驗(yàn)。

2

結(jié)

果

2.1

死亡情況

PCA 試驗(yàn)：各組死亡 3 只；正常對照組和模型組：各死亡 2 只，剩余 10 只；中藥高劑量組、辛芩組：各死亡 1 只，剩余 11 只。

2.2

PCA 試驗(yàn)

PCA 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，以正常對照組血清接種的大鼠背部無藍(lán)斑出現(xiàn)。以其余各組血清接種的大鼠背部，分別于 1:4，1:16，1:64，1:256 濃度處均出現(xiàn)藍(lán)斑，直徑最大的為 1.5 cm，最小的為 0.5 cm，濃度越小藍(lán)斑越小。

2.3

行為學(xué)改變

A 組僅偶有抓鼻現(xiàn)象，個別豚鼠打噴嚏；B 組于鼻腔滴入抗原后頻繁用前爪抓鼻，打噴嚏，并伴有清水樣鼻涕，部分豚鼠涕流滿面；其余各組癥狀輕微，出現(xiàn)輕度抓鼻及少數(shù)噴嚏，部分可見鼻涕。模型組與其余各組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P < 0.05），正常對照組與各實(shí)驗(yàn)組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），結(jié)果見表 1。

3

討

論

變應(yīng)性鼻炎是一類主要由 IgE 介導(dǎo)的Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)性疾病，近年來發(fā)現(xiàn)細(xì)胞因子水平與變應(yīng)性鼻炎的發(fā)病關(guān)系密切[7，8]。

中藥的許多藥材經(jīng)現(xiàn)代研究表明，具有調(diào)整機(jī)體免疫狀況的作用，必將在變應(yīng)性鼻炎的治療中占據(jù)重要的地位。如黃芪可調(diào)節(jié)體液免疫，從而抑制組胺等介質(zhì)的釋放；細(xì)辛、桂枝等對過敏介質(zhì)有拮抗作用；防風(fēng)、甘草、辛荑、五味子、烏梅、蟬蛻均有抗過敏作用。

筆者在多年的臨床實(shí)踐中認(rèn)識到，變應(yīng)性鼻炎的發(fā)生主要是由肺氣虛弱，衛(wèi)外不固，導(dǎo)致外邪侵襲而成鼻鼽。此外，本病與先天腎氣不足和后天脾失健運(yùn)也有非常密切的關(guān)系。歷代醫(yī)家多采用補(bǔ)肺固表、健脾扶正、補(bǔ)腎溫陽等方法辨證論治，方藥多采用玉屏風(fēng)散、小青龍湯、桂枝湯、麻黃附子細(xì)辛湯等加減治療本病。固本祛風(fēng)湯即是在玉屏風(fēng)散的基礎(chǔ)上加減而成。主要由制附子、黃芪、桂枝、全蟲、辛荑花、防風(fēng)、肉桂、徐長卿、茯苓、甘草等組成，本方以制附子、肉桂補(bǔ)腎溫陽；茯苓健脾利水；黃芪、桂枝益氣固表、助陽化氣；輔以防風(fēng)、辛荑祛風(fēng)通竅，全蟲搜風(fēng)活絡(luò)，徐長卿祛風(fēng)止癢。綜觀全方，具有補(bǔ)肺散寒，健脾益腎，祛風(fēng)通竅之功效?，F(xiàn)代藥理研究認(rèn)為，黃芪具有雙向免疫調(diào)節(jié)作用，附子、防風(fēng)、辛荑、徐長卿均有抗炎及增強(qiáng)免疫作用，可以降低炎癥細(xì)胞的通透性，減輕其水腫、浸潤等炎性反應(yīng)，辛荑還可以抗組胺及收斂鼻黏膜血管，減輕變應(yīng)性鼻炎所致的鼻癢、打噴嚏、流涕等癥狀。實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示， 固本祛風(fēng)湯治療組癥狀顯著低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），表明固本祛風(fēng)湯可以顯著改善變應(yīng)性鼻炎的癥狀，減輕其炎癥反應(yīng)，從而達(dá)到治療變應(yīng)性鼻炎的作用。

參考文獻(xiàn)

〔1〕Monika ME， Garl A， Jonas S. Degranulation status of airway tissue eosinophils in mouse models of allergic airway inflammation 〔J〕. Res Cell Mole Bio1， 2001， 24(3):352-359

〔2〕李華斌， 韓德民. IL-9與呼吸道炎癥〔J〕. 國外醫(yī)學(xué)耳鼻咽喉科學(xué)分冊， 2003， 27(2):75-77

〔3〕Saito H， Matsumoto K， Denburg AE， et al. Pathogenesis of murine experimental allergic Rhinitis: A Study of local and systemic consequences of IL-5， Deficiency〔J〕. J Immunol， 2002， 168(6):3017-3023

〔4〕燕志強(qiáng)， 章鳳新. 嗜酸性細(xì)胞功能研究進(jìn)展〔J〕. 國外醫(yī)學(xué)耳鼻咽喉科學(xué)分冊， 2004， 28(5):304-307

〔5〕毛輝， 王曾民. CD34+細(xì)胞與支氣管哮喘〔J〕. 國外醫(yī)學(xué)呼吸系統(tǒng)分冊， 2002， 22(4):190-193

〔6〕Sehmi R， Wood LJ， Watson R， et al. A1lergu-induced increases in IL-5 receptor alpha-subunit expression on bone marrow-derived Cd34+ cells from asthmatic subjects〔J〕. Clin Invest， 1997， 120:2457-2466

〔7〕Bjermer L， Diamant Z. Current and emerging nonsteroidal anti-inflammatory therapies targeting specific mechanisms in asthma and allergy〔J〕. Treat Respir Med， 2004， 3(4):235-246

篇5

【摘要】 ：目的 圍繞海馬結(jié)構(gòu)的形態(tài)學(xué)研究定志小丸的抗抑郁機(jī)制。方法 40只雌性大鼠分為對照組、抑郁癥模型組(模型組)、蒸餾水組(DW組)和定志小丸組(中藥組)，Open field法檢測行為學(xué)得分，ELISA法檢測血清皮質(zhì)醇和雌二醇(E2)含量，HE染色和電鏡技術(shù)觀察海馬CA3區(qū)神經(jīng)元形態(tài)，免疫組化技術(shù)檢測齒狀回神經(jīng)干細(xì)胞(NSC)增殖。結(jié)果 與對照組比較，模型組和DW組行為學(xué)得分及血清E2含量顯著下降，皮質(zhì)醇水平升高和NSC增殖明顯降低，海馬CA3區(qū)神經(jīng)元損傷明顯；中藥組行為學(xué)得分和血清E2含量無明顯變化，皮質(zhì)醇明顯減少，NSC增殖顯著增加，海馬CA3區(qū)神經(jīng)元基本正常。結(jié)論 定志小丸能夠保護(hù)海馬結(jié)構(gòu)，這可能是其抗抑郁機(jī)制之一。

【關(guān)鍵詞】 抑郁癥　定志小丸　雌二醇　神經(jīng)干細(xì)胞　皮質(zhì)醇　大鼠

Abstract：Objective To study the anti-depression mechanism of Dingzhixiaowan concerning on histology of hippocampal formation. Methods 40 female rats were pided into control， depression model group (model group)， distilled water group (DW group) and Dingzhixiaowan group (Chinese herb group). Behavior points were measured by open field method. Serum concentrations of cortisol and estradiol (E2) were checked with ELISA. HE staining and electron microscopy were applied to observe the histology of neurons in hippocampal formation. Immunohistochemistry method was employed to detect Nestin expression. Results Compared with the control， behavior points， serum E2 level and Nestin expression decreased obviously and serum cortisol level increased markedly， CA3 neurons were seriously damaged in model and DW groups. While behavior points， serum E2 level did not change， Nestin expression increased obviously and serum cortisol level decreased markedly， CA3 neurons were basically normal in Chinese herb groups. Conclusion Dingzhixiaowan can protect hippocampal formation， which might be one of the anti-depression mechnisms.

Key words：depression；Dingzhixiaowan；estradiol；neural stem cell；cortisol；rat

目前認(rèn)為，慢性應(yīng)激刺激造成的海馬結(jié)構(gòu)損傷是抑郁癥發(fā)病的主要原因。對海馬結(jié)構(gòu)來說，糖皮質(zhì)激素是損傷激素，雌激素為保護(hù)激素，而女性的雌激素水平變化較大，其保護(hù)作用時(shí)常減弱，這可能是女性抑郁癥發(fā)病率較高的原因。本研究以此為出發(fā)點(diǎn)，研究定志小丸的抗抑郁機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物及分組

成年Wistar雌性大鼠(230±20)g，遼寧中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供，合格證號：SCXK(遼)2004-0018。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，選擇體重和行為學(xué)得分相近的40只大鼠，隨機(jī)分為對照組、模型組、蒸餾水組(DW組)和定志小丸組(中藥組)，每組10只。對照組每籠5只飼養(yǎng)，其余3組每籠1只飼養(yǎng)。

1.2 抑郁癥模型的建立

除對照組外，其余3組動物均接受慢性應(yīng)激刺激，復(fù)制慢性不可預(yù)見性應(yīng)激模型。其方法是：在21 d內(nèi)施加電擊足底(36 V交流電，5 min)、冰水游泳(4 ℃，5 min)、搖晃(1 min)、夾尾(1 min)、禁水(24 h)、禁食(24 h)等刺激，每種刺激3～4次。

1.3 給藥

對照組不給藥；模型組只施加灌胃動作；DW組灌服1 mL蒸餾水；中藥組灌服定志小丸。定志小丸為人參、茯苓、遠(yuǎn)志、石菖蒲的標(biāo)準(zhǔn)提取物(購于安徽宣城百草生物有限公司，提純比例為5∶1)，劑量分別是10、10、6、6 g，溶于適量水中，加熱后濃縮為1 kg/L。按成人用量折算成灌胃劑量[1 mL/100(g? d)]，于刺激前1 h灌服。

1.4 大鼠行為學(xué)檢測

采用Open field法檢測，以3 min內(nèi)大鼠水平穿越方格數(shù)作為水平活動得分，以前肢抬起次數(shù)為垂直活動得分。檢測過程中保證時(shí)間、光照、溫度及環(huán)境噪音的一致性。檢測由3人同時(shí)完成，1人負(fù)責(zé)計(jì)時(shí)，1人負(fù)責(zé)觀察大鼠的水平活動，1人負(fù)責(zé)計(jì)數(shù)垂直活動。正式檢測前，3人首先熟悉檢測標(biāo)準(zhǔn)，并進(jìn)行多次訓(xùn)練，盡量減少人為誤差。

1.5 血清皮質(zhì)醇和雌二醇檢測

在第22天，大鼠腹腔注射20%氨基甲酸乙酯(0.4 mL/100 g)麻醉后，腹主動脈取血，離心后取血清，凍存?zhèn)溆?。于總醫(yī)院內(nèi)分泌實(shí)驗(yàn)室采用ELISA方法檢測血清皮質(zhì)醇和雌二醇(E2)含量。

1.6 海馬組織學(xué)觀察

將取血后的大鼠用150 mL生理鹽水經(jīng)主動脈快速沖洗，取一側(cè)海馬行常規(guī)HE染色，另一側(cè)于掃描電鏡下觀察形態(tài)學(xué)變化。

1.7 齒狀回神經(jīng)干細(xì)胞(NSC)增殖檢測

采用Nestin免疫組化方法，取經(jīng)生理鹽水快速沖洗后的海馬，4%多聚甲醛固定4～6 h，30%蔗糖溶液沉底。冰凍連續(xù)切片，片厚25 μm，隔4片取1片。將切片置含新鮮0.5% H2O2的純甲醇中30 min；0.1% Triton溶液中30 min；正常山羊血清60 min；兔抗鼠Nestin一抗(1∶2000，Sigma)，25 ℃孵育1 h，4 ℃過夜；生物素化山羊抗兔IgG(博士德二抗試劑盒)，室溫下60 min；SABC復(fù)合物，室溫60 min；DAB顯色(博士德)。染色對照：用正常山羊血清和PBS代替Nestin一抗作孵育，其余步驟同上。利用BI-2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)，計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示，采用SPSS11.5進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)變化

光鏡下可見，對照組CA3區(qū)有大量致密錐體細(xì)胞，排列整齊，細(xì)胞完整，邊緣清晰，死亡細(xì)胞較少；模型組和DW組可見細(xì)胞層次減少、紊亂、中斷，大量細(xì)胞壞死；中藥組神經(jīng)元形態(tài)與對照組基本接近。電鏡下可見，對照組細(xì)胞器豐富，輪廓清晰，細(xì)胞核呈圓形，核膜清晰光滑完整，核染色質(zhì)分布均勻；模型組和DW組細(xì)胞器減少，線粒體空泡化，細(xì)胞核變小，不規(guī)則，且核膜增厚，核周電子密度降低；中藥組與對照組基本相同。

2.2 各組大鼠齒狀回Nestin表達(dá)

鏡下可見Nestin免疫陽性反應(yīng)產(chǎn)物呈棕黃色，環(huán)形分布于核膜周圍。對照組鏡下可見較多的棕黃色反應(yīng)物，邊緣相對清晰，細(xì)胞大小相近；模型組和DW組棕黃色反應(yīng)物較少，邊緣不清，細(xì)胞大小不一致；中藥組鏡下可見大量棕黃色反應(yīng)物，邊緣清晰，細(xì)胞大小一致。各組Nestin陽性細(xì)胞數(shù)見表1。表1 各組大鼠Nestin陽性細(xì)胞數(shù)(略)注：與對照組比較，*P

2.3 各組大鼠行為學(xué)得分

(見表2)表2 各組大鼠的行為學(xué)得分(略)注：與本組第0天比較，P

2.4 各組大鼠血清皮質(zhì)醇和雌二醇含量

(見表3)表3 各組大鼠血清皮質(zhì)醇和雌二醇含量變化(略)

3 討論

海馬結(jié)構(gòu)具有調(diào)節(jié)內(nèi)臟功能、情緒和行為的多種作用，主要由海馬和齒狀回組成。齒狀回存在NSC，能夠增殖、遷移至海馬CA3區(qū)，分化形成新的神經(jīng)細(xì)胞。因?yàn)橐种讫X狀回NSC增殖后，許多抗抑郁藥物會失效，所以，海馬CA3與齒狀回的關(guān)系在抑郁癥發(fā)病中的作用逐漸受到重視。抑郁癥的發(fā)病機(jī)制目前認(rèn)為是慢性應(yīng)激刺激引起腎上腺皮質(zhì)過度分泌糖皮質(zhì)激素，繼而損傷海馬神經(jīng)元。本實(shí)驗(yàn)也觀察到同樣現(xiàn)象。由于高水平的糖皮質(zhì)激素還能抑制齒狀回NSC增殖，從而降低了海馬結(jié)構(gòu)的自我修復(fù)能力[1]，繼而導(dǎo)致海馬結(jié)構(gòu)出現(xiàn)不可逆損傷。因此，抑郁癥的根治應(yīng)圍繞保護(hù)海馬成熟神經(jīng)元和齒狀回NSC兩方面進(jìn)行。

定志小丸由遠(yuǎn)志、石菖蒲、茯苓和人參組成，具有祛痰開竅、健脾益智作用，主治心氣不定、五臟不足、憂悲不樂等。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方能夠?qū)孤詰?yīng)激對大鼠行為學(xué)的影響，具有抗抑郁作用，這可能與其保護(hù)海馬CA3區(qū)神經(jīng)元和齒狀回NSC增殖有關(guān)。盡管定志小丸不能抑制皮質(zhì)醇的過度分泌，但其維持E2水平的作用可能更為重要，因此，該方可能是替代雌激素的一種選擇，成為治療女性抑郁癥的備選藥物。

篇6

【關(guān)鍵詞】　CCI模型；　大鼠；　疼痛行為學(xué)；　痛閾

疼痛是人們一生中經(jīng)常遇到的不愉覺，它提供軀體受到威脅的警報(bào)信號，是生命不可缺少的一種特殊保護(hù)功能。另一方面，它又是各種疾病最常見的癥狀，也是當(dāng)今困擾人類健康最嚴(yán)重的問題之一。根據(jù)神經(jīng)生理功能，疼痛可分為生理性疼痛和病理性疼痛，神經(jīng)病理性疼痛是由神經(jīng)系統(tǒng)損傷或異常引起的一種難以治療的疼痛狀態(tài)。CCI模型是最常用的神經(jīng)病理性疼痛動物模型。本研究主要觀察CCI模型大鼠疼痛行為學(xué)表現(xiàn)。

1　資料與方法

1.1　實(shí)驗(yàn)動物　SPF級SD大鼠，6~8周齡，雄性，體重180~200 g，購自川北醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心。動物飼養(yǎng)環(huán)境安靜，有良好的通風(fēng)和空氣過濾系統(tǒng)，室溫22 ℃左右，濕度50%左右，明暗光照12 h:12 h，自由攝食，隔日更換籠具和墊料。動物適應(yīng)環(huán)境3 d。雄性SD大鼠(n=48只)隨機(jī)分為三組，即正常對照組(Nave組：n=16，分7、14 d亞組，每亞組8只)、假手術(shù)組(Sham組：n=16，分7、14 d亞組，每亞組8只)以及CCI組(n=16，分7、14 d亞組，每亞組8只)。

1.2　CCI模型的建立　(1)按Bennet和Xie[1]方法制作CCI模型；(2)稱重：采用腹腔給藥10%水合氯醛麻醉，300~500 mg/kg。側(cè)臥位，手術(shù)側(cè)在上，消毒，鋪巾，選擇左后肢，在股骨下方約l cm平行于股骨切開皮膚，用小剝離子經(jīng)股二頭肌間隙鈍性分離肌肉，暴露坐骨神經(jīng)，用神經(jīng)剝離子輕柔將坐骨神經(jīng)與周圍軟組織分離；(3)在坐骨神經(jīng)分成三支前的主干部位游離神經(jīng)7 mm左右，在距神經(jīng)起始處(三支分叉處)上方2 mm處，用4.0含鉻羊腸線結(jié)扎坐骨神經(jīng)4道，每道間隔約1 mm，使被結(jié)扎的神經(jīng)長約4~5 mm。注意結(jié)扎的松緊度，以打結(jié)時(shí)可見肌肉輕微抽動為準(zhǔn)；(4)局部生理鹽水沖洗，間斷縫合肌肉筋膜、皮下組織以及皮膚；術(shù)畢將大鼠放入鼠籠，于溫暖、安靜環(huán)境自由喂養(yǎng)；(5)假手術(shù)組除不結(jié)扎坐骨神經(jīng)外，其余同模型組；手術(shù)由同一人操作。

1.3　行為學(xué)觀察　在手術(shù)后2周內(nèi)，每隔1~2 d觀察1次，包括大鼠的步態(tài)和左后肢的姿勢、局部皮膚以及肌肉張力的改變程度、是否存在舔咬肢體現(xiàn)象等。

1.4　機(jī)械刺激傷害感受閾值(MWT)的測量　在安靜的環(huán)境中，將大鼠單獨(dú)放置于透明的有機(jī)玻璃體中，待大鼠適應(yīng)環(huán)境15~30 min后，以Electronic von Frey刺激針刺激大鼠左、右足底，每只大鼠刺激3次，間隔大于10 s。大鼠會出現(xiàn)抬足、縮足、快速甩足以及甩足后舔足等反應(yīng)。將3次讀數(shù)取平均值作為機(jī)械縮足反射閾值(MWT)。各組于術(shù)前、術(shù)后第1、3、6、8、10、13天進(jìn)行測量。測量時(shí)間固定為9:00~13:00。術(shù)前測定值為基礎(chǔ)機(jī)械痛閾。

1.5　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理　采用PASW Statistics 18軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料以(x±s)表示，兩組樣本均數(shù)間的比較用t檢驗(yàn)，組間比較采用重復(fù)資料方差分析和post hoc檢驗(yàn)，P

2　結(jié)果

2.1　大鼠行為學(xué)變化　CCI大鼠術(shù)后健康狀況良好，體重?zé)o明顯減輕，毛發(fā)富有光澤，覓食飲水基本正常。術(shù)后1~2周，手術(shù)足趾并攏輕度外翻，下肢行走無力，步態(tài)呈現(xiàn)跛行，經(jīng)常左后足懸空或不敢著地；站立時(shí)以右后肢持重，左后肢抬起并緊貼于腹部；術(shù)后14 d左右，左后肢出現(xiàn)比較明顯的肌肉萎縮，給予輕微von Frey刺激時(shí)，大鼠經(jīng)常迅速將左后肢抬起，有時(shí)放入口中舔吮；CCI大鼠左后肢懸空時(shí)間常超過25 s，CCI大鼠無自噬肢體現(xiàn)象。

2.2　大鼠體重變化　CCI組大鼠術(shù)后健康狀況良好，體重?zé)o明顯減輕，但體重增長較Sham組和Nave組略慢。各組大鼠術(shù)前基礎(chǔ)值、術(shù)后第1、3天體重比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在術(shù)后第6、8、10、13天，CCI組大鼠體重與Nave組、Sham組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)，見表1。

2.3　機(jī)械刺激傷害感受閾(MWT)變化　各組大鼠術(shù)前機(jī)械性痛閾比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。手術(shù)前、后Nave組大鼠痛閾與Sham組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。各組大鼠非術(shù)側(cè)機(jī)械性痛閾比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。CCI組大鼠術(shù)側(cè)痛閾在手術(shù)后第3、6、8、10、13天明顯低于非手術(shù)側(cè)，亦明顯低于Sham組和Nave組(P

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關(guān)鍵詞：黑逍遙散；老年性癡呆；動物行為；氫溴酸東莨菪堿；乙酰膽堿酯酶；膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶；小鼠

中圖分類號：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1005-5304（2013）10-0035-03

阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s Disease，AD）是一種常見的以進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙和行為損害為特征的神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變。目前的治療主要是根據(jù)其不同病理生理學(xué)說給予對應(yīng)性干預(yù)，尚未找到有效的防治藥物。從中醫(yī)藥中尋找有效防治藥物，成為近年研究的熱點(diǎn)。本研究選用黑逍遙散組、逍遙散組及其精簡方組開展相關(guān)研究，探討黑逍遙散防治AD的作用機(jī)理，為本病的辨證論治提供新的思路與有效治療藥物。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動物

SPF級KM小鼠50只，雌雄各半，體質(zhì)量（20±2）g，甘肅中醫(yī)學(xué)院科研實(shí)驗(yàn)動物中心提供，動物質(zhì)量合格證編號：SCXK（甘）2004-0006-0000994，實(shí)驗(yàn)設(shè)施使用許可證編號：SYXK（甘）2004-0006-0000308。動物分籠飼養(yǎng)，食固體飼料（甘肅中醫(yī)學(xué)院科研實(shí)驗(yàn)動物中心提供），食水自由，室溫20～25 ℃，相對濕度45%～52%。

1.2 藥物與試劑

實(shí)驗(yàn)所用藥材均購于甘肅中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥房；黑逍遙散、逍遙散、精簡方中各藥用量參照2005年版《中華人民共和國藥典》及全國高等中醫(yī)院校規(guī)劃《方劑學(xué)》確立的比例。黑逍遙散：熟地黃∶柴胡∶當(dāng)歸∶白芍∶白術(shù)∶茯苓∶生姜∶炙甘草∶薄荷=7.5∶5∶5∶5∶5∶5∶5∶4∶1。逍遙散為黑逍遙散去熟地黃，精簡方則進(jìn)一步減去白芍、薄荷、生姜、炙甘草。各組藥物加水冷浸3 h，16倍量水微沸1 h，煎煮2次后合并濾液，制成濃度均為0.50 g原藥材/mL的水提液。

氫溴酸東莨菪堿注射液，上海禾豐制藥有限公司生產(chǎn)，批號100101?？捡R斯亮藍(lán)蛋白（批號20100520）、乙酰膽堿酯酶（AchE）試劑盒（批號20100522）、膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶（ChAT）試劑盒（批號20100522）均由南京建成生物化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)。

1.3 儀器與設(shè)備

Y型水迷宮（自制），甘肅中醫(yī)學(xué)院科研實(shí)驗(yàn)中心提供；小鼠避暗自動測試儀（型號BA-200），購于成都泰盟科技有限公司；小鼠跳臺儀（型號DT-200），購于成都泰盟科技有限公司；E200NIKON光鏡，由甘肅中醫(yī)學(xué)院科研實(shí)驗(yàn)中心提供。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 實(shí)驗(yàn)動物篩選

在正式實(shí)驗(yàn)前，用Y型水迷宮對小鼠進(jìn)行游泳測試，以剔除先天運(yùn)動功能障礙小鼠。

2.2 分組與給藥

KM種小鼠隨機(jī)分為分為空白組、模型組、黑逍遙散組、逍遙散組、精簡方組，每組10只?？瞻捉M和模型組小鼠每日灌胃生理鹽水0.02 mL/g，藥物組給予相應(yīng)的原藥材水煎液。按照人臨床給藥劑量折算動物給藥劑量倍數(shù)，各組劑量均為2.314 g/（kg?d），每日灌胃1次，連續(xù)10 d。

2.3 水迷宮、跳臺、避暗測試

灌胃給藥第6、8日，除空白組外，其余各組小鼠均在灌胃1 h后腹腔注射氫溴酸東莨菪堿（2.0 mg/kg）進(jìn)行造模[1]，注射20 min后使用水迷宮進(jìn)行學(xué)習(xí)能力跳臺、避暗訓(xùn)練，第10日同法造模后進(jìn)行行為學(xué)能力測試。

2.4 生物化學(xué)檢測

灌胃給藥第10日，行為學(xué)能力測試完畢后，處死動物，迅速取出腦組織，用生理鹽水制成10%勻漿，放入低溫離心機(jī)中，3000 r/min離心10 min，取上清液裝入試管中冷凍備用，按照試劑盒說明書進(jìn)行AchE和ChAT的測定。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)以―x±s表示，組間均數(shù)比較采用方差分析。P

4 結(jié)果

4.1 Y型水迷宮測試結(jié)果

與空白組比較，模型組小鼠的錯誤次數(shù)顯著升高，記憶潛伏時(shí)間顯著延長，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P

4.2 跳臺測試結(jié)果

與空白組比較，模型組小鼠受到電擊的次數(shù)增多，記憶潛伏時(shí)間顯著縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P

4.3 避暗測試結(jié)果

與空白組比較，模型組小鼠受到電擊的次數(shù)增多，記憶潛伏時(shí)間顯著縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P

4.4 黑逍遙散對癡呆小鼠腦組織勻漿中乙酰膽堿酯酶膽堿、乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的影響

與空白組比較，模型組小鼠腦組織勻漿中的ChAT活性顯著降低，AchE活性顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P

5 討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，老年癡呆的發(fā)生病位在腦，與心、腎最為密切，屬本虛標(biāo)實(shí)，治療多從益氣補(bǔ)血、滋補(bǔ)心腎、活血祛瘀、化痰解毒等立法。而我們通過中醫(yī)文獻(xiàn)回顧分析，結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究成果，認(rèn)為肝郁是導(dǎo)致瘀血、痰濁等標(biāo)實(shí)的主因，提出了從肝、脾論治的新假說。因肝主疏泄條達(dá)，氣能行血，氣能行水，肝郁則氣滯，氣滯則血瘀，水停而成痰濁。根據(jù)這一假說，我們首先選取疏肝健脾的代表方黑逍遙散進(jìn)行了研究，表明該方具有顯著改善AD模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力，增強(qiáng)其認(rèn)知、判斷能力，調(diào)節(jié)腦內(nèi)相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)[2]。說明黑逍遙散能通過疏肝理氣、養(yǎng)血活血、健脾除濕而發(fā)揮補(bǔ)其虛（補(bǔ)血填精以益髓）、祛其邪（行氣、化痰、活血）的作用。

黑逍遙散是在逍遙散的基礎(chǔ)上加地黃一味，為逍遙散演化類方，養(yǎng)血填精之力更強(qiáng)?，F(xiàn)代藥理研究表明，熟地黃通過激活MAP等發(fā)揮出抗氧化作用；可以提高超氧化物歧化酶、一氧化氮合酶活性，減少丙二醛和過氧化脂質(zhì)含量，能改善衰老大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，延緩大鼠腦衰老[3-4]。因此，我們選用黑逍遙散與逍遙散開展對照研究，以進(jìn)一步驗(yàn)證藥效，印證從肝、脾論治AD的科學(xué)性和有效性。

本研究結(jié)果表明：黑逍遙散組、逍遙散組及精簡方組均能減少水迷宮測試中錯誤次數(shù)，縮短潛伏時(shí)間；減少在跳臺、避暗測試中電擊次數(shù)，延長潛伏期時(shí)間；均能升高腦組織勻漿ChAT活性、降低AchE活性，與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P

參考文獻(xiàn)：

[1] 陳奇.中藥藥理研究方法學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1994：118-119.

[2] 吳紅彥，王虎平.以肝、脾論治AD及逍遙散對老年癡呆模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力、中樞膽堿能神經(jīng)元活性的影響[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志， 2010，16（5）：168-170.

[3] Park C， So HS， Kim SJ， et al. Samul extract protects against the H2O2-induced apoptosis of H9c2 cardiomyoblasts via activation of extracellular regulated kinases（Erk）1/2[J]. Am J Chin Med， 2006，34（4）：695-706.

[4] 安紅梅，史云峰，胡兵，等.熟地黃對D-半乳糖衰老模型大鼠腦衰老的作用研究[J].中藥藥理與臨床，2008，24（3）：59-60.

篇8

關(guān)鍵詞：頤腦解郁復(fù)方；卒中后抑郁；行為學(xué)；海馬CA1區(qū)；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.07.012

中圖分類號：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1005-5304（2017）07-0049-05

Abstract： Objective To investigate the intervention effects of Yinao Jieyu Prescription on the behaviors and damages in hippocampal CA1 area of the rats with post-stroke depression （PSD）. Methods Totally 168 SPF male SD rats were randomly divided into normal group， sham-operation group， stroke group， PSD group， Western medicine group and TCM group. There were 24 rats in the normal group and sham-operation group， and 30 rats in the other groups. Rats in the normal group received no intervention. Rats in the sham-operation group received no suture. Rats in the stroke group were given middle cerebral artery occlusion operation and normally fed after operation. Rats in the PSD group， Western medicinal group and TCM group were made into PSD models by chronic immobilization stress for one week and individual battery to the end. At the inception of modeling， Western medicine group received fluoxetine hydrochloride for gavage； TCM group received Yinao Jieyu Prescription for gavage； other groups received distilled water for gavage， once a day. At the end of week 2， 4， and 8， the morphology of the hippocampal CA1 area in each rat was observed by microscope after HE stained. Results Except for the week 2， at the same time point， the behavior scores of the rats in the TCM group were higher than those in the PSD group. At the same time point， the CA1 region of the hippocampus in the TCM group was more complete than the PSD group， and the cells were arranged neatly and in normal morphology. Conclusion Yinao Jieyu Prescription can improve the symptoms of PSD rats， and has protective effects on hippocampal CA1 area.

Key words： Yinao Jieyu Prescription； post-stroke depression； behaviors； hippocampal CA1 area； rats

卒中后抑郁（post-stroke depression，PSD）是R床腦卒中后常見并發(fā)癥，主要表現(xiàn)為情緒低落、思維遲滯、興趣減退及社會角色的紊亂等。我國每年大約有160萬～200萬新發(fā)腦卒中患者，約1/3存活患者發(fā)生PSD[1-2]。頤腦解郁復(fù)方是本課題組自行研制治療PSD的中藥復(fù)方，具有益腎疏肝、活血化瘀的功效，前期臨床研究顯示療效顯著[3]。本實(shí)驗(yàn)建立一種高度模擬臨床PSD的大鼠模型，以探討頤腦解郁復(fù)方對PSD大鼠行為學(xué)及海馬CA1區(qū)的干預(yù)作用。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動物

SPF級健康雄性SD大鼠168只，2月齡，體質(zhì)量（300±20）g，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，動物許可證號SCXK（京）2012-0001。飼養(yǎng)于室溫（20±2）℃、相對濕度50%～60%環(huán)境，光照明暗交替12 h/12 h，自由攝食飲水。

1.2 藥物及制備

頤腦解郁復(fù)方，北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院提供，依據(jù)前期研究[4]確定灌胃劑量為9.92 g/（kg?d），按照灌胃劑量煎藥濃縮，濃度為0.62 g原藥材/mL，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，用前加熱；鹽酸氟西汀膠囊，禮來（蘇州）制藥公司，批號0943A，臨用時(shí)溶于蒸餾水，濃度為0.233 g/L，按照成人用量7倍計(jì)算大鼠用量為2.33 mg/（kg?d）。

1.3 主要試劑與儀器

戊巴比妥鈉（美國Sigma公司，貨號P3761-5），磷酸鹽緩沖液（粉劑，福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，貨號PBS-0060），尼龍栓線（北京沙東生物技術(shù)有限公司，貨號2838-A4），蘇木素染色液（北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司，編號201506251323），水溶性伊紅染色液（北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司，編號YZB/京0102-2011），返藍(lán)染色液（北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司，編號2015032514324659）。曠場試驗(yàn)用敞箱（自制），強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)用水箱（自制），自動化智能型正置研究級顯微鏡（奧林巴斯有限公司，型號BX53）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組

大鼠實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，采用隨機(jī)數(shù)字法分為正常組24只、假手術(shù)組24只、卒中組30只、PSD組30只、西藥組30只、中藥組30只。正常組不干預(yù)，假手術(shù)組不插入線栓，卒中組僅進(jìn)行卒中手術(shù)，PSD組、西藥組和中藥組均在卒中手術(shù)后1周進(jìn)行PSD模型制備。自造模開始至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，西藥組和中藥組大鼠分別灌胃氟西汀、頤腦解郁復(fù)方藥液，其余各組每日灌胃等量蒸餾水。根據(jù)大鼠體質(zhì)量計(jì)算氟西汀、頤腦解郁復(fù)方藥液每日灌胃量，自腦卒中造模開始至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，每次約3～4 mL，每日1次。

2.2 造模

參考新式線栓法[5]，制備大腦中動脈阻塞的腦卒中模型，缺血2 h后進(jìn)行再灌注。入組標(biāo)準(zhǔn)：大鼠于缺血2 h后出現(xiàn)對側(cè)前肢蜷曲、行走D圈或行走向?qū)?cè)倒體征則納入，無此體征或于2 h后仍不清醒者棄去。待腦卒中大鼠造模成功1周后，大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)后，將群養(yǎng)的PSD組、西藥組、中藥組大鼠分開單籠飼養(yǎng)至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。孤養(yǎng)同時(shí)，每日10：00～16：00期間任取時(shí)間，將大鼠限制在特制的T型束縛臺[6]（自制）上予2 h的行為限制，連續(xù)7 d。

2.3 觀測方法

2.3.1 曠場試驗(yàn) 第2、4、8周末對各組大鼠進(jìn)行曠場試驗(yàn)。將大鼠置于敞箱中心方格內(nèi)，觀察大鼠3 min內(nèi)水平穿越格數(shù)（記為水平運(yùn)動得分）、后肢直立次數(shù)（記為垂直運(yùn)動得分）。

2.3.2 強(qiáng)迫游泳試驗(yàn) 第2、4、8周末對各組大鼠進(jìn)行強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)。大鼠禁食21 h，水箱內(nèi)水深25 cm、水溫（25±1）℃，連續(xù)觀察5 min，記錄大鼠在水中強(qiáng)迫游泳時(shí)間。

2.3.3 糖水偏愛試驗(yàn) 第2、4、8周末對各組大鼠進(jìn)行糖水偏愛試驗(yàn)。大鼠禁食禁水20 h后，同時(shí)給予每只大鼠事先定量好的1瓶1%糖水和1瓶純水。30 min后調(diào)換糖水和純水的位置，60 min后取走2瓶并稱量，計(jì)算大鼠糖水消耗比例。糖水偏愛度=糖水消耗量÷總液體消耗量。

2.3.4 病理觀察 第2、4、8周末大鼠行為學(xué)測試后，各時(shí)點(diǎn)大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉（0.5 mL/100 g）麻醉，開胸暴露心臟，0.9%氯化鈉溶液快速灌注，再用4%多聚甲醛先快后慢灌注固定，斷頭取腦，4%多聚甲醛溶液內(nèi)室溫固定36 h，石蠟包埋后做冠狀切片，HE染色，光鏡下觀察海馬CA1區(qū)結(jié)構(gòu)變化。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以―x±s表示，組間比較采用方差分析，方差不齊用Welch法分析，兩兩比較用LSD法。P

4 結(jié)果

4.1 曠場試驗(yàn)結(jié)果

在2、4、8周時(shí)，同一時(shí)點(diǎn)PSD組大鼠與卒中組比較水平運(yùn)動得分均降低，4周時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P

4.2 強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)結(jié)果

在2、4、8周時(shí)，同一時(shí)點(diǎn)PSD組大鼠與卒中組比較強(qiáng)迫游泳時(shí)間均減少，2、4周時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P

4.3 糖水偏愛試驗(yàn)結(jié)果

PSD組大鼠與卒中組比較，同一時(shí)點(diǎn)糖水偏愛度均降低，4、8周時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P

4.4 大鼠海馬CA1區(qū)病理觀察結(jié)果

2周時(shí)，正常組和假手術(shù)組大鼠海馬CA1區(qū)結(jié)構(gòu)完整，有3～4層細(xì)胞，排列緊密，呈圓形或橢圓形，胞核、核仁清晰；卒中組大鼠海馬CA1區(qū)結(jié)構(gòu)尚完整，細(xì)胞較假手術(shù)組排列疏松，有2～3層細(xì)胞，細(xì)胞染色加深、核固縮，核仁不明顯；PSD組大鼠海馬CA1區(qū)有2～3層細(xì)胞，較卒中組更加疏松，細(xì)胞染色深、核固縮，核仁不明顯，形態(tài)不規(guī)則，部分細(xì)胞呈空泡狀；西藥組和中藥組大鼠海馬CA1區(qū)結(jié)構(gòu)完整，有3～4層正常細(xì)胞，排列緊密，核仁清晰，有少量細(xì)胞出現(xiàn)深染現(xiàn)象（見圖1）。4周時(shí)，正常組和假手術(shù)組大鼠海馬CA1區(qū)與2周時(shí)比較改變不明顯；卒中組大鼠海馬CA1區(qū)結(jié)構(gòu)尚完整，有1～2層細(xì)胞，較正常組排列疏松，細(xì)胞染色加深、核固縮，核仁不明顯；PSD組大鼠海馬CA1區(qū)結(jié)構(gòu)不完整，有1～2層細(xì)胞，較卒中組受損加重，大量細(xì)胞呈空泡狀；西藥組和中藥組大鼠海馬CA1區(qū)結(jié)構(gòu)完整，有2～3層正常細(xì)胞，排列較緊密，有少量細(xì)胞出現(xiàn)深染現(xiàn)象，正常細(xì)胞周圍出現(xiàn)淺粉色結(jié)構(gòu)（見圖2）。

8周時(shí)，正常組和假手術(shù)組大鼠海馬CA1區(qū)與4周時(shí)比較變化不明顯；卒中組大鼠海馬CA1區(qū)結(jié)構(gòu)不完整，有1～2層細(xì)胞，染色深、核固縮，核仁不明顯；PSD組大鼠海馬CA1區(qū)結(jié)構(gòu)不完整，細(xì)胞量少，多呈空泡狀；西藥組和中藥組大鼠海馬CA1區(qū)結(jié)構(gòu)完整，有1～2層正常細(xì)胞，排列較緊密，細(xì)胞呈圓形或橢圓形，核仁清晰，深染細(xì)胞較少（見圖3）。

5 討論

本實(shí)驗(yàn)在腦缺血模型基礎(chǔ)上應(yīng)用慢性束縛應(yīng)激復(fù)合單籠飼養(yǎng)方法制備PSD大鼠模型，觀察頤腦解郁復(fù)方對PSD大鼠行為學(xué)及海馬CA1區(qū)的干預(yù)作用。實(shí)驗(yàn)中采用線栓法制備腦卒中模型，在充分考慮大鼠腦卒中病理基礎(chǔ)上，選用刺激溫和、量小的慢性束縛應(yīng)激結(jié)合孤養(yǎng)的方法制備PSD大鼠模型。該模型既有腦缺血卒中和抑郁發(fā)病的病理基礎(chǔ)，又有卒中后肢體活動受限、離開親友等情志刺激因素，模擬了PSD發(fā)生的生物學(xué)和心理學(xué)因素[7]，操作較簡單，造模成功率高，是理想的PSD大鼠模型。行為學(xué)測試結(jié)果顯示，4周時(shí)可成功建立PSD大鼠模型。

海馬與人類的學(xué)習(xí)及情感等認(rèn)知功能密切相關(guān)，是介導(dǎo)應(yīng)激反應(yīng)的最重要的腦區(qū)之一。研究表明，PSD大鼠存在腦卒中損傷側(cè)海馬神經(jīng)再生障礙，而海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡會引發(fā)一系列抑郁癥狀[8]。本實(shí)驗(yàn)觀察了大鼠缺血側(cè)海馬CA1區(qū)病理變化，發(fā)現(xiàn)PSD組大鼠海馬CA1區(qū)較卒中組受損嚴(yán)重，應(yīng)用藥物干預(yù)的西藥組與中藥組大鼠海馬CA1區(qū)受損情況明顯減輕，提示PSD加重卒中后海馬CA1區(qū)受損情況，而中藥頤腦解郁復(fù)方可改善海馬CA1區(qū)受損情況，保護(hù)腦內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞。

中醫(yī)“腦髓”的現(xiàn)代生物學(xué)基礎(chǔ)是腦內(nèi)神經(jīng)元和神經(jīng)營養(yǎng)因子。腎主生髓，“補(bǔ)腎填髓”中藥可減少神經(jīng)元死亡，促進(jìn)神經(jīng)元存活與再生[9]。肝主疏泄，主藏血，具有調(diào)暢氣機(jī)、調(diào)節(jié)血量的職能，腦的血供和營養(yǎng)依賴于肝所藏之血及肝的疏泄功能[10]。研究表明，舒肝活血中藥復(fù)方能改善中風(fēng)后抑郁狀態(tài)[11]，并可保護(hù)腦內(nèi)神經(jīng)元，緩解細(xì)胞凋亡[12]。本課題組認(rèn)為腦卒中多因腎虛髓海失充，元神失養(yǎng)致病，而后情志不遂，肝氣失調(diào)，痰瘀互結(jié)，發(fā)生PSD。病位在肝腎二臟，腎虛為基礎(chǔ)，又兼氣、痰、瘀阻滯。故課題組選用補(bǔ)腎填精、疏肝活血中藥，立頤腦解郁復(fù)方以益腎舒肝、活血化瘀、頤腦醒神。行為學(xué)及病理結(jié)果顯示，頤腦解郁復(fù)方可改善大鼠PSD癥狀，減輕大鼠海馬CA1區(qū)受損情況，保護(hù)海馬CA1區(qū)細(xì)胞。

有研究表明，益腎舒肝中藥復(fù)方可顯著增強(qiáng)PSD大鼠腦內(nèi)膠質(zhì)纖維酸性蛋白、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、堿性成纖維生長因子等表達(dá)[13]，參與調(diào)節(jié)PSD的多條信號通路[14-15]，但其防治機(jī)制是一個復(fù)雜的過程，目前研究尚未完全闡明。本實(shí)驗(yàn)從行為學(xué)和病理改變探討頤腦解郁復(fù)方對PSD的干預(yù)作用，研究尚不深入，未來將在神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化及信號分子的變化方面加以探索。

參考文獻(xiàn)：

[1] 韓琳，陳寧，何俐.抗抑郁藥預(yù)防卒中后抑郁有效性的Meta分析[J].中國循證醫(yī)學(xué)雜志，2015，15（10）：1153-1160.

[2] 白慧東，婁育紅，楊國萍，等.逍遙散治療腦卒中后抑郁療效的Meta分析[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2010，17（9）：26-27，76.

[3] 裴清華，唐啟盛，程遠(yuǎn).益腎調(diào)氣法治療腦卒中后抑郁（血瘀型）臨床研究[J].吉林中醫(yī)藥，2008，28（7）：487-488.

[4] 李俠，唐啟盛，侯秀娟，等.腦卒中后抑郁模型大鼠腦單胺遞質(zhì)變化及中藥頤腦解郁方的干預(yù)作用[J].中國臨床康復(fù)，2006，10（47）：49-51.

[5] 范瑞娟，羅亞非，孫玉鳳.新式線栓法建立大鼠局灶性腦缺血再灌注模型的建立[J].中國民族民間醫(yī)藥，2014，31（6）：26-27.

[6] 陳家旭，李偉，趙歆，等.三種中藥復(fù)方對慢性束縛應(yīng)激大鼠皮層和海馬BDNF、TrkB的影響[J].中國病理生理雜志，2007，23（7）：1296-1300.

[7] 謝偉堅(jiān).缺血性腦卒中后抑郁相關(guān)因素分析[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2011， 8（18）：67-68.

[8] HUANG X， MAO Y S， LI C， et al. Venlalaxine inhibits apoptosis of hippocampal neurons by up-regulating brain-derived neurotrophic factor in a rat depression model[J]. Pharmazie，2014，69：909-916.

[9] 李林，魏海峰，張?zhí)m，等.中醫(yī)“腎生髓，腦為髓?！爆F(xiàn)代生物學(xué)基礎(chǔ)探討[J].中國中藥雜志，2006，31（17）：1397-1400.

[10] 戎志斌，郭文鵬，姚乃禮.從肝論治腦病[J].中國中醫(yī)藥信息雜志， 2014，21（5）：114-116.

[11] 魏玖月，奚燕萍.卒中后抑郁癥的中醫(yī)治療[J].中醫(yī)臨床研究，2013， 5（24）：109-111.

[12] 樊蔚虹，姚建平，趙文景.柴胡疏肝散對卒中后抑郁大鼠海馬組織Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的影響[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17（3）：181-183.

[13] 唐啟盛，司銀楚，裴清華，等.頤腦解郁方對腦卒中后抑郁狀態(tài)模型大鼠腦內(nèi)GFAP、BDNF、bFGF的影響[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，28（4）：32-35.

[14] 趙瑞珍，黃育玲，唐啟盛，等.頤腦解郁方對腦出血后抑郁大鼠腦內(nèi)PI-3K、Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響[J].中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2008，36（6）：12-14.

[15] 唐啟盛，趙瑞珍，李小黎，等.頤腦解郁方對抑郁大鼠腦內(nèi)ERK通路的影響[J].中華中醫(yī)藥雜志，2012，27（3）：619-621.

篇9

【摘要】 探討柴郁溫膽湯及其拆方對抑郁大鼠血清ACTH、COR和海馬cAMP的影響。［方法］健康雄性SD大鼠84只，隨機(jī)分為正常組、模型組、柴郁溫膽湯組、化痰組、調(diào)氣血組、養(yǎng)心脾組、馬普替林組。參照Katz刺激方法制備慢性輕度不可預(yù)見性應(yīng)激(CUMS)抑郁模型。采用放射免疫法測血清ACTH、COR和大鼠海馬cAMP含量。［結(jié)果］與正常組相比，模型組大鼠血清ACTH和COR水平明顯升高、海馬cAMP含量明顯降低。同模型組相比，柴郁溫膽湯組及調(diào)氣血組能明顯降低ACTH濃度(P

【關(guān)鍵詞】 柴郁溫膽湯；組分；抑郁癥；HPA軸；ACTH；COR；cAMP

UniversityAbstract:［Objective］ To explore the effects of the traditional Chinese drugs Chaiyuwendantang (CYWDT) and its component on the plasm levels of ACTH， COR and cAMP in hippocampus of depressed mode. ［Methods］ Eighty-four male rats were pided into seven groups: control group， depressed model group， group of CYWDT， group of HuaTan， group of TiaoQiXue， group of YangXinPi， group of maprotiline equally and made up models in chronic unpredictable mild stress (CUMS). The plasm levels of ACTH， COR and the level of cAMP in hippocampus were detected by radioimmunoassay. ［Results］ We found that the plasm levels of ACTH， COR were significantly increase and cAMP in hippocampus was significantly decreasd in depression model of rat. CYWDT and TiaoQiXue could significantly decreased the level of ACTH(P＜0.05); CYWDT， HuaTan and TiaoQiXue could significantly decreased the level of COR(P＜0.01). CYWDT， HuaTan and TiaoQiXue could significantly increase the level of cAMP in hippocampus. ［Conclusion］ Chronic unpredictable mild stress can increase the plasm levels of ACTH， COR and the level of cAMP in hippocampus of depression rats. CYWDT could reverse all the changes. The mechanism maybe relatd to regulate hypothalamicpituitaryadrenal axis and signal transmission in cell.

Key words: Chaiyuwendantang; component;depression; hypothalamicpituitaryadrenal axis; adrenocorticotropic hormone; cortisol; cyclic adenosine monophosphate

抑郁癥(depression)是最常見的心境障礙，嚴(yán)重威脅人類的身心健康。我們在前期研究中證實(shí)柴郁溫膽湯對腦單胺類神經(jīng)遞質(zhì)代謝紊亂具有良好的調(diào)節(jié)作用，且可明顯增加大鼠海馬部位PKA表達(dá)［1］。本實(shí)驗(yàn)擬觀察柴郁溫膽湯及其拆方對抑郁大鼠血清ACTH、COR和海馬cAMP的影響。并與四環(huán)類抗抑郁藥馬普替林相對照，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

(1) 實(shí)驗(yàn)動物:健康SpragueDawley(SD)雄性大鼠84只，體重（180±20）g，由南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供(許可證號：SCXK(蘇)20020031)。所有大鼠均用普通飼料喂養(yǎng)兩周后開始造模。(2)實(shí)驗(yàn)藥品:柴郁溫膽湯組（柴胡、郁金、半夏、陳皮、竹茹、枳實(shí)、人參、茯苓、炙甘草）濃度為1.84g生藥量/ml。化痰組（半夏、陳皮、竹茹）濃度為0.64g生藥量/ml。調(diào)氣血組（柴胡、郁金、枳實(shí)）濃度為0.6g生藥量/ml。養(yǎng)心脾組（人參、茯苓、炙甘草、大棗）濃度為0.5g生藥量/ml。以上藥物的煎制和濃縮均手工操作，所用煎藥器具為陶瓷制品以保證藥物在煎制過程中的穩(wěn)定性。濃縮后的藥物中每種單味藥的濃度在整方和拆方中均相同，以保證各組實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可比性。鹽酸馬普替林(北京諾華制藥有限公司生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字H19991047)用去離子雙蒸水配制成1mg/ml藥物混懸液。(3)主要實(shí)驗(yàn)試劑和儀器　促腎上腺皮質(zhì)激素(adrenocorticotropic hormone ACTH)放射免疫分析試劑盒(北京北方生物技術(shù)研究所)、皮質(zhì)醇(cortisol COR)放射免疫分析試劑盒(北京華英室溫技術(shù)研究所)、環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate cAMP)放射免疫分析試劑盒(上海中醫(yī)藥大學(xué)核醫(yī)學(xué)試驗(yàn)室)。儀器：GC911γ放射免疫計(jì)數(shù)器(科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及給藥

選取Openfield評分相近的大鼠84只，隨機(jī)分為正常組、模型組、柴郁溫膽湯組、化痰組、調(diào)氣血組、養(yǎng)心脾組、馬普替林組，每組12只。各治療組在應(yīng)激的第2天開始均按提取液(濃縮后)1ml/100g灌胃給藥；模型組和正常組給予等量生理鹽水。每天上午8時(shí)給藥1次，持續(xù)至實(shí)驗(yàn)的第23天。

1.2.2 模型制備

正常組每籠飼養(yǎng)6只，正常攝水飲食，不給任何刺激。其余各組，每只均單籠飼養(yǎng)，并接受21天各種不同的應(yīng)激刺激，參照Katz方法［2］，每天隨機(jī)給予一種刺激。使大鼠不能預(yù)料刺激的發(fā)生，以避免產(chǎn)生適應(yīng)。

1.2.3 行為學(xué)測定

Openfield法測定行為 所用自制敞箱規(guī)格為高40cm、直徑80cm的內(nèi)空圓柱桶，周壁為黑色，地面用黑線劃分為面積相等的25塊。以動物四肢完全進(jìn)入一個分區(qū)作為一個水平活動(crossing)得分、以雙前肢完全抬離地面至放下作為一次垂直活動(rearing)得分、以及觀察大鼠的理毛(修飾)次數(shù)和大便顆粒數(shù)。每只動物僅進(jìn)行一次測定，每次觀察3min。

1.2.4 糖水消耗實(shí)驗(yàn)

在實(shí)驗(yàn)第22天所有實(shí)驗(yàn)大鼠均單籠飼養(yǎng)并禁食和禁水，只給1%蔗糖溶液150ml，計(jì)算大鼠24h飲用1%蔗糖溶液量。

1.2.5 大鼠血清ACTH和COR測定

用10%水合氯醛(0.36ml/100g) 給大鼠腹腔注射，麻醉后開腹，腹主動脈抽取血液5ml，待測ACTH和COR。按試劑盒方法要求分離血清，采用125I標(biāo)記放免法測定。

1.2.6 大鼠海馬cAMP含量測定

按大鼠腦立體定向圖譜(包新民等編著，人民衛(wèi)生出版社，1991年)定位，冰上分離大鼠一側(cè)海馬，裝于凍存管并立即投入液氮中，待固化后稱重，放入-86℃冰箱保存待測。檢測時(shí)海馬置于pH4.75的醋酸緩沖液中勻漿，加入無水乙醇沉淀蛋白，離心取上清液。采用125I標(biāo)記放免法測定cAMP含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件對兩組間均數(shù)進(jìn)行兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和F檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

各組大鼠行為學(xué)變化，見表1。表1 柴郁溫膽湯及其組分對大鼠行為學(xué)評分的影響(略)．與正常組比較 P

3 討論

對于抑郁大鼠的行為學(xué)觀察多采用經(jīng)典的Openfield法，目前比較肯定的觀察指標(biāo)是大鼠的水平運(yùn)動得分和垂直運(yùn)動得分。本試驗(yàn)觀察了大鼠的修飾次數(shù)以及大便顆粒數(shù)。其中水平得分代表動物的活動度；垂直得分代表動物對新鮮事物的好奇程度和對外界環(huán)境的探究興趣［2］。修飾次數(shù)代表了動物對周圍環(huán)境的要求和自身的關(guān)注程度，大便顆粒數(shù)反應(yīng)了CUMS抑郁模型大鼠是否有便秘的抑郁癥常見并發(fā)癥。結(jié)果顯示復(fù)方柴郁溫膽湯能夠顯著提升抑郁模型大鼠的水平得分、垂直得分、修飾次數(shù)和大便顆粒數(shù)。相對于馬普替林，更是顯示了少或無馬普替林的抗膽堿能副作用—便秘。

本實(shí)驗(yàn)研究觀察到模型組大鼠血清ACTH和COR濃度較正常組顯著增高，與上述文獻(xiàn)報(bào)道一致，這也進(jìn)一步證實(shí)模型組大鼠存在HPA軸功能亢進(jìn)。柴郁溫膽湯組和調(diào)氣血組能能夠逆轉(zhuǎn)ACTH的升高；柴郁溫膽湯組、化痰組和調(diào)氣血組能逆轉(zhuǎn)大鼠COR水平的增高；馬普替林組能夠同時(shí)逆轉(zhuǎn)ACTH和COR的升高。說明柴郁溫膽湯具有調(diào)節(jié)HPA軸功能紊亂的作用，強(qiáng)度與馬普替林相似，其中起主要作用的是化痰和調(diào)氣血組分。

cAMP是細(xì)胞內(nèi)第二信使，可介導(dǎo)多種細(xì)胞內(nèi)激素、神經(jīng)遞質(zhì)及其他信號分子的作用。本試驗(yàn)研究表明，模型組大鼠海馬cAMP含量較正常組明顯降低。柴郁溫膽湯組、化痰組、馬普替林組均能夠逆轉(zhuǎn)這種改變，提示柴郁溫膽湯參與了細(xì)胞信號通路的調(diào)節(jié)，其中起主要作用的是化痰藥，可能為其抗抑郁機(jī)理之一。

參考文獻(xiàn)

篇10

【關(guān)鍵詞】老年癡呆 行為學(xué)指標(biāo) 腦內(nèi)有關(guān)物質(zhì)含量檢測指標(biāo) 腦組織形態(tài)學(xué)觀察指標(biāo) 血液檢測指標(biāo)

中圖分類號：R592文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：1005-0515（2010）12-030-03

【ABSTRACT】Objective To sum up and appraisal the evaluating indicators and methods of treating senile dementia. Methods Former indicators were summarized from four aspects of the behavior indicator, the examination indicator of related material content in brain, the brain tectology observation indicator and the blood examination indicator and other indicators were carried on the forecast. Results Through the discussion of drug efficacy targets and the methods,it provides newly and important data for the senile dementia mechanism and the treatment research. Conclusion There is a very important significance to find the effective mathods to prevent and treat the senile dementia by intensively studing main evaluating indicators and methods of treating senile dementia .

【KEY WORDS】Senile dementia; Behavior indicator; Examination indicator of related material content in brain; Brain tectology observation indicator ; Blood examination indicator

眾所周知，人類社會己經(jīng)逐漸進(jìn)入老齡化社會，老年癡呆已成為威脅人類晚年身心健康的主要疾病之一，患病率呈逐年上升趨勢。資料顯示，研究者已針對腦的結(jié)構(gòu)、功能和信息傳遞的新認(rèn)知開發(fā)出了許許多多的治療藥物，且防治效果顯著，但相關(guān)藥效評價(jià)指標(biāo)多散在于浩如煙海的文獻(xiàn)中，為此本文總結(jié)相關(guān)文獻(xiàn)，從行為學(xué)指標(biāo)、腦內(nèi)有關(guān)物質(zhì)含量檢測指標(biāo)、腦組織形態(tài)學(xué)觀察指標(biāo)、血液檢測指標(biāo)四個方面對藥物治療老年癡呆進(jìn)行藥效評價(jià)，為老年癡呆機(jī)理和治療的研究提供新的、重要的數(shù)據(jù)源。

1 行為學(xué)指標(biāo)

1.1 水迷宮指標(biāo)

20世紀(jì)80年代初，Morris發(fā)明了水迷宮，它是一種測量空間學(xué)習(xí)和記憶能力的實(shí)驗(yàn)方法，可用來評估嚙齒動物由于老年癡呆等因素所造成的學(xué)習(xí)記憶的影響，目前已被認(rèn)為是此類研究的經(jīng)典。

Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)由兩個主要的實(shí)驗(yàn)組成，分別是定向航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)。

定向航行實(shí)驗(yàn)時(shí)，將動物從之前劃分好的四個象限中隨機(jī)放入，在最大游泳時(shí)間內(nèi)，可以記錄并作為評價(jià)指標(biāo)的主要是逃避潛伏期（指大鼠自進(jìn)入迷宮開始至找到平臺所需的時(shí)間，經(jīng)典的水迷宮實(shí)驗(yàn)以此作為主要指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析），除此之外還有游泳路程長度（指大鼠自進(jìn)入迷宮開始至找到平臺游過的總距離。它是逃避潛伏期和平均游泳速度的乘積，是一個綜合指標(biāo)，受兩者共同的影響，既可以反映大鼠對平臺位置的學(xué)習(xí)記憶能力，又反映了大鼠的運(yùn)動能力）、游泳速度（指大鼠進(jìn)入水迷宮運(yùn)動的快慢，速度的快慢，一般并不反映大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，僅反映大鼠的游泳能力。但在某種程度上，大鼠的逃避潛伏期短，那么相對消耗的體力也會少，速度也可能會較快。速度較快，那么，行程也可能會較長）、入水角度（指大鼠進(jìn)入水迷宮后開始運(yùn)動的方向與入水點(diǎn)和平臺連線的夾角。如果與逃避潛伏期結(jié)合分析，在某種程度上可以彌補(bǔ)單純考慮時(shí)間的不足）、搜索策略等可作為評價(jià)指標(biāo)的補(bǔ)充，在分析過程中起參考作用，這個實(shí)驗(yàn)主要用于評價(jià)動物的空間學(xué)習(xí)能力。對于最大游泳時(shí)間，各實(shí)驗(yàn)人員有不同看法，通常選擇 120s，90s或60s。最大游泳時(shí)間會在統(tǒng)計(jì)中由于個別動物而影響整組數(shù)據(jù)，特別是選擇較大的游泳時(shí)間時(shí)，因此，應(yīng)該在實(shí)驗(yàn)前做好動物的篩選工作，并在統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)時(shí)去掉異常值。

定向航行實(shí)驗(yàn)進(jìn)行幾天后（按動物學(xué)習(xí)情況定），開始空間探索實(shí)驗(yàn)，將平臺撤去，一般探索時(shí)間在90s或60s內(nèi)[2]，可以記錄并作為評價(jià)指標(biāo)的主要有尋求原平臺的次數(shù)（也就是跨平臺次數(shù)：是在撤去平臺后，動物穿越原平臺所在位置的次數(shù)，反應(yīng)動物尋找平臺的能力，與原平臺象限停留時(shí)間結(jié)合起來考慮更能反應(yīng)大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力的變化）、原平臺象限的游泳時(shí)間，原平臺象限游泳時(shí)間占總時(shí)間百分比，這個實(shí)驗(yàn)主要用于評價(jià)動物的空間記憶能力。

水迷宮實(shí)驗(yàn)作為老年癡呆動物的評價(jià)指標(biāo)來說充分而又準(zhǔn)確的，是最常用的評價(jià)治療老年癡呆藥效的指標(biāo)，但是它也有不足之處，Graziano [3]認(rèn)為簡單地使用目前常用的觀測指標(biāo)不能準(zhǔn)確的反映真實(shí)的搜索策略，于是選擇了一些自定義的行為種類、大量的數(shù)值變量和重要區(qū)域，使用判別式分析的方法來獲得較高的準(zhǔn)確率。Graziano的這種方法雖然準(zhǔn)確但是種類繁多比較復(fù)雜，所以我們進(jìn)行日常實(shí)驗(yàn)時(shí)，只要選擇主要的評價(jià)指標(biāo)補(bǔ)充幾個次要指標(biāo)就可以清楚地反映實(shí)驗(yàn)的結(jié)果了。

1.2 跳臺實(shí)驗(yàn)指標(biāo)

跳臺實(shí)驗(yàn)是藥理學(xué)常用的評價(jià)動物對藥物及其他給予的干預(yù)后的神經(jīng)行為學(xué)中一個測試現(xiàn)象較為明顯的實(shí)驗(yàn)，也就是測量大小鼠記憶能力的變化的實(shí)驗(yàn)。跳臺實(shí)驗(yàn)指標(biāo)是評價(jià)藥效常用的指標(biāo)之一，從文獻(xiàn)的記錄中看實(shí)屬完善成熟。

檢測方法：將大鼠或小鼠放入跳臺儀內(nèi)適應(yīng)環(huán)境,然后通電,大多數(shù)跳上跳臺逃避電擊。從通電到完全穩(wěn)定上臺所用的時(shí)間為潛伏期,跳下時(shí)大鼠雙足同時(shí)接觸銅柵視為錯誤反應(yīng),訓(xùn)練并記錄訓(xùn)練時(shí)間內(nèi)的潛伏期和錯誤次數(shù)作為學(xué)習(xí)指標(biāo)。24h后重測,先將大鼠或小鼠放在跳臺上,記錄第1次跳下跳臺時(shí)間為潛伏期,并記錄錯誤次數(shù)作為記憶能力指標(biāo)。

2腦內(nèi)有關(guān)物質(zhì)含量檢測指標(biāo)

老年癡呆發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，多種信號通路參與此過程，許多信號分子在其中發(fā)揮重要作用[4]。目前已公認(rèn)，學(xué)習(xí)記憶與中樞膽堿神經(jīng)系統(tǒng)關(guān)系極為密切。研究還表明，患者的癡呆程度與皮質(zhì)和海馬中信號分子的缺失程度密切相關(guān)，在患者腦中，基底前腦的膽堿能神經(jīng)細(xì)胞明顯丟失，膽堿能神經(jīng)纖維發(fā)生退變，AchE、谷氨酸、p-KER2等在腦內(nèi)的表達(dá)出現(xiàn)異常，尤以皮質(zhì)和海馬顯著。

2.1 膽堿酯酶（AchE）活性的檢測

膽堿酯酶是膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿的水解酶直接參與自主神經(jīng)功能調(diào)節(jié)、肌肉運(yùn)動、大腦思維記憶等重要功能。研究證實(shí)老年癡呆患者中樞膽堿能系統(tǒng)損傷，AchE活性和突觸前膽堿能標(biāo)志在多處腦區(qū)均顯著降低或缺失患者基底前腦區(qū)膽堿能神經(jīng)元丟失，從基底節(jié)到皮質(zhì)，膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(ChAT)活性降低和乙酰膽堿酯酶(AChE)活性明顯升高，造成乙酰膽堿 (ACh)的合成、儲存和釋放減少，皮質(zhì) ACh受體數(shù)目減少，產(chǎn)生癡呆癥狀 [5]?？偟膩碚f，老年癡呆患者腦組織中膽堿乙?；富钚悦黠@降低，膽堿酯酶活性顯著升高，造成 ACh含量不足，導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙，出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶及認(rèn)知功能下降，甚至智力喪失[6]。因此AchE活性的檢測作為評價(jià)老年癡呆藥效的主要指標(biāo)，且在藥效評價(jià)中的使用甚為頻繁。

檢測方法：斷頭法處死實(shí)驗(yàn)動物后，迅速取腦，用預(yù)冷的生理鹽水沖凈表面血液，用濾紙吸干，去除軟腦膜血管。取右腦稱重，置微型勻漿器中，加無水乙醇研磨，再加生理鹽水充分研磨制成勻漿。冷凍離心機(jī)離心，取上清液。用羥胺比色法測定AChE活性(可按照試劑盒說明書進(jìn)行操作)。

2.2 谷氨酸含量的測定

谷氨酸是腦內(nèi)主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，介導(dǎo)興奮性突觸傳遞，并與長時(shí)程增強(qiáng)（long term potentiation LTP）的形成密切相關(guān) [7]，也作為老年癡呆藥效的相關(guān)評價(jià)之一。

檢測方法：在海馬組織中加入HCL溶液，冰浴下超聲勻漿，低溫離心，取上清液加入正亮氨酸為內(nèi)標(biāo)物，利用異硫氰酸苯酯衍生，用內(nèi)標(biāo)法測定谷氨酸含量[8]。

2.3 p-KER2含量的測定

p-KER2含量測定：將海馬組織放到預(yù)冷的裂解液中。低溫超聲粉碎后，離心，取上清液分裝。用Braford法測定蛋白質(zhì)含量，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品。用磷酸化抗體，常規(guī)Western蛋白印跡法測定p-KER2含量[9]。掃描蛋白條帶，進(jìn)行吸光度分析，吸光度值代表p-KER2含量。

2.4 Aβ和S.P含量的測定

Aβ由分泌酶水解β淀粉樣前體蛋白產(chǎn)生，稱為β-淀粉樣肽，Aβ生成的增多對神經(jīng)元有毒性作用[10]，大腦海馬組織形態(tài)也發(fā)生明顯的變化。而Aβ被認(rèn)為是導(dǎo)致神經(jīng)元損傷及認(rèn)知功能衰退的主要致病物質(zhì)[11]。

S.P是世界上發(fā)現(xiàn)最早的神經(jīng)肽，研究表明，S.P與學(xué)習(xí)記憶功能有關(guān)，且對中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有保護(hù)作用，向人們提示了其對老年性癡呆等神經(jīng)系統(tǒng)疾病具有潛在的防治價(jià)值[12]。

因此Aβ和S.P含量的測定對藥效的評價(jià)有著重要的作用。

2.5 皮質(zhì)的蛋白含量的測定

檢測方法：分離腦皮質(zhì)，稱重，組織加入磷酸鹽緩沖液（PBS）液，在組織勻漿器中充分研磨后，離心，吸取上清液，用PBS按1:4的比例配成組織勻漿液。最后用酶標(biāo)儀微量比色法測定皮質(zhì)勻漿液的蛋白含量。

3 腦組織形態(tài)學(xué)觀察指標(biāo)

3.1 海馬病理形態(tài)觀察

海馬組織主要負(fù)責(zé)存儲信息,是人學(xué)習(xí)和記憶的關(guān)鍵部位。海馬結(jié)構(gòu)的整合是空間學(xué)習(xí)的基礎(chǔ)，海馬區(qū)的受損影響大鼠學(xué)習(xí)行為的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，和臨床患者健忘、癡呆等表現(xiàn)是一致的[13] 。海馬萎縮被看成是與記憶損傷相關(guān)的重要指標(biāo)，也是評價(jià)藥效的主要指標(biāo)之一。

檢測方法：斷頭處死，開顱取出完整的腦組織，用10%的福爾馬林固定，切取腦組織，石蠟包埋，連續(xù)切片，行HE常規(guī)染色，進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察。

3.2 檢測海馬及邊緣系統(tǒng)的膽堿能神經(jīng)元丟失狀況

老年癡呆患者的病理學(xué)特征是大量神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)纖維纏結(jié)、細(xì)胞外老年斑和彌漫性腦萎縮[14]。計(jì)算神經(jīng)元數(shù)目檢測海馬及邊緣系統(tǒng)的膽堿能神經(jīng)元丟失狀況可以直觀簡單地推測出患者的生理狀態(tài)，是評價(jià)藥效的重要指標(biāo)。

3.3 病理組織切片及免疫組織化學(xué)染色

病理組織切片及免疫組織化學(xué)染色只要在光學(xué)顯微鏡下，老年癡呆動物模型內(nèi)部結(jié)構(gòu)的病理變化就一目了然，從而透徹地解析老年癡呆的病因和發(fā)病機(jī)制。

檢測方法：開顱取腦后固定、脫水等過程后，進(jìn)行冠狀冷凍切片。切片PBS沖洗，經(jīng)過溶于 PBST進(jìn)行過氧化反應(yīng)，封閉處理后，加入鼠抗搖勻、孵育過夜。然后，在室溫下加入生物素化羊抗鼠IgG搖勻、孵育，室溫?fù)u勻、孵育，顯色。最后，經(jīng)過常規(guī)粘片、干燥、脫水、透明、封片，光學(xué)顯微鏡下觀察并拍攝。

4 血液檢測指標(biāo)

近年來的研究表明，血液指標(biāo)的檢測不僅可預(yù)測患上老年癡呆的風(fēng)險(xiǎn)，其準(zhǔn)確率高達(dá)90%，還可以作為不可或缺的藥效評價(jià)指標(biāo)，專家認(rèn)為，血液檢測有望為人類防治老年癡呆癥帶來革命性變化。

4.1 血清β淀粉樣蛋白、轉(zhuǎn)化生長因子及類胰島素樣生長因子Ⅱ水平檢測

分泌酶水解β淀粉樣前體蛋白產(chǎn)生Aβ,而Aβ又是導(dǎo)致認(rèn)知功能衰退的主要致病物質(zhì)，所以老年癡呆伴有β-淀粉樣蛋白沉積，可通過檢測血清β淀粉樣蛋白的水平來估計(jì)Aβ的含量。

檢測方法：取血分離血清,血清β淀粉樣蛋白、轉(zhuǎn)化生長因子及類胰島素樣生長因子Ⅱ檢測采用放免法。

4.2 超氧化物岐化酶(SOD)和丙二醛(MDA)羥自由基的含量檢測

檢測方法：快速開胸，心臟取血，離心取血清，置于低溫保存，按試劑盒說明書，紫外分光光度法檢測超氧化物岐化酶(SOD)和丙二醛(MDA)羥自由基的含量觀察動物腦組織形態(tài)學(xué)的病理變化。

4.3 血液流變學(xué)檢測

研究表明，血液流變學(xué)異常是導(dǎo)致血液成分改變的主要因素之一。有研究認(rèn)為，高黏血癥是癡呆的危險(xiǎn)因素之一。其機(jī)制可能與血液黏滯度異常則血流變慢，血液黏稠度增加而致腦血流量下降，腦部缺血缺氧，損害大腦的學(xué)習(xí)記憶功能有關(guān)[15]。血液流變學(xué)檢測也可以評價(jià)藥物療效的好壞。

5 小結(jié)

到目前為止，各種藥效評價(jià)指標(biāo)層出不窮，除了上述常用的指標(biāo)外，按照每種治療方法或者藥物對此疾病改善的不同，檢測的指標(biāo)也會有所不同，如晚期老年癡呆存在嚴(yán)重氨基酸代謝障礙，腦脊液，血漿中興奮性氨基酸谷氨酸、天門冬氨酸含量的測定具有重要價(jià)值；老年癡呆能引起nNOS和NO表達(dá)增加，而MTPG(代謝型谷氨酸受體阻斷劑α-甲基-（4-四唑基-苯）甘氨酸能阻斷老年癡呆誘導(dǎo)的nNOS表達(dá)增加[16]，因此nNOS含量的檢測在MTPG這種受體阻斷劑的影響下有相對重要的意義等。還有血糖指標(biāo)，海馬顳葉中D2受體變化、載脂蛋白E的含量等等都與老年癡呆的機(jī)理息息相關(guān)，由于這些指標(biāo)多而雜是近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，還未得到廣泛的應(yīng)用及證實(shí)，還未成熟，故本文只選取了一些成熟、常用、重要且有效的指標(biāo)及其檢測方法進(jìn)行整理歸類，為以后的研究提供更方便的查找途徑，但是歸類的指標(biāo)中也還很多細(xì)節(jié)到現(xiàn)在為止還沒有透徹，值得進(jìn)一步研究、完善，使其更加適用于老年癡呆的機(jī)制探討和藥理研究。

這些評價(jià)指標(biāo)的整理與總結(jié)以老年癡呆藥理學(xué)的研究為基礎(chǔ)，以評價(jià)藥效為目的，從而為多層次、多角度深入研究老年癡呆的發(fā)病機(jī)理奠定了基礎(chǔ)，為藥物治療老年癡呆提供更多的途徑，有利于進(jìn)一步提高藥物治療老年癡呆的療效以及臨床價(jià)值，并為研究開發(fā)療效更高、毒性更小的治療老年癡呆的藥物提供更多思路。

參考文獻(xiàn)

[1]毛雪璇,皮榮標(biāo).Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)影響因素的研究進(jìn)展.中國行為醫(yī)學(xué)科學(xué)2008年9月第17卷第9期

[2] de Bruin N.Mahieu M .Patel T.et a1.Performance of F2 B6x129 hybrid mice in the Morris water maze.latent inhibition and preoulse inhibition paradigms:Comparison with C57BI/6J and 129sv inbred mice.Behav Brain Res,2006,172:122-134．

[3] Gmziano A,Petrosini L,Bartoletti A.Automatic recognition nf explorative strategies in the Morris water maze.J Neuosci Methods,2003,130:33-44．

[4] Yang Yun,Bian Guangxing,Lu Qiujun.Chinese Journal of New Drugs2008,Vol.17 No.1

[5]Piceardi M,Congiu D,Squassina A,et a1.Alzhelrner s disease case―control associationstudy of polymorphisms in ACHE CHAT,and BCHE genes in a Sardinian sample[J].Am J MeGenet B Neuropsychiatr Genet,2007,144(7):895 ―899.

[6]周亞賓.醒神丸對老年性癡呆動物模型行為學(xué)和腦內(nèi)膽堿酯酶活性的影響[J],中國中醫(yī)藥科技,2000,7(3):1501.

[7] Watkins JC,Jane DE.The glutamate story[J].Br J Pharmacol,2006,147(Suppl1):S100-S108

[8]Yang J,Sun LG,Bai XZ,Zhou HT.Simultaneous determination of 18 amino acids by reverd-phase high performance liquid chromatography with precolumn phenylisothiocyanate derivatization[J]. Chin J Chromatogr(色譜),2002, 20(4):369-371.

[9] Yang J, Sun LG，Cai K, Zong ZH, Xing W, Liu SY, et al. Effect of acute and chronic lead exposure on CAI-long term potentiantion and active extracellular signal-regulated kinase 2 of rat hippocampus[J].Chin J Pharmacol Toxicol(中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志),2004,18(1):66-70

[10] Tskeda A,Loveman E,Clegg A,et al.A systematic review of the clinical effectiveness of donepozil, rivastigmmine and adverse eventsin Alzheimer’s disease[J]. Int JC,eriatr Paychiatry, 2006,21(5):17.

[11] Frost D,Gorman PM,Yip CM,et a1.Co-incorporation of A beta 40 and A beta 42 to form mixed pre-fibrillar aggregates,Eur J Biochem,2003,270(4):654-663.

[12 ] 葉靜,劉協(xié)和,鄧紅,等.β-淀粉樣多肽誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡和caspase-3蛋白表達(dá)的研究[J].中國神經(jīng)精神病雜志,2003,29(6):465.

[13] Bezard E,Gross CE,Qin L-DOPA reverses the MPTP-induced elevation of the arrestin2 and GRK6 expression and enhanced ERK activation in monkeybrain[J].Neurbiol Dis,2005,18(2):323.

[14] Liu Donghua,Bi Minggang.Journal of International Pharmaceutical Research 2009 Oct;36(5).